生物素化荧光素酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及生物素化荧光素酶的制备方法。
【背景技术】
[0002]生物素化(b1tinylat1n)是指将生物素共价连接到蛋白质、核酸或其它分子上的过程。由于生物素的分子量不大(分子量为244.31)，生物素化反应快速、高效且不易被干扰。生物素化的分子能通过生物素与链霉亲和素、亲和素互作，且不受高热、pH、蛋白酶解的影响。生物素与链霉亲和素、亲和素的结合特异且高效，因此这一互作在生物技术的许多领域有着广泛的应用。另外，多个生物素化分子可以发生交联来形成个科研人员感兴趣的蛋白，同时允许和多个链霉亲和素、亲和素、中性亲和素蛋白结合，增加了对此蛋白的检测灵敏度。此外还有大量的生物素化分子的应用有待开发。
[0003]荧光素酶(Luciferase)是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyrali’的萤火虫体内的荧光素酶。在相应化学反应中，荧光的产生是来自于荧光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷。没有荧光素酶的情况下，荧光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应。
[0004]荧光素酶被生物素修饰之后就可以同亲和素进行固相亲和作用。生物素与亲和素是一对特异性相当高的亲和配体，并且具有解离速率慢、不易受干扰等特点。目前，生物素化的手段有化学修饰和生物修饰，但修饰后的生物素化蛋白活性普遍不高。生物素化的荧光素酶可应用于焦磷酸测序反应中，酶活会直接影响到测序反应的准确度，所以急需找到一种可操作性强，产物活性高的制备方法。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是一种生物素化荧光素酶的制备方法，包括以下步骤:
(1)使用PBS缓冲液溶解荧光素酶；
(2)活化生物素；
(3)将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂中，加入荧光素酶，按照生物素与荧光素酶摩尔比(22-25):1的比例混合，搅拌，得到混合溶液；
(4)使用PBS缓冲液对混合溶液进行透析，去除杂质和游离生物素；
(5)使用280nm的吸光度测定蛋白含量；
(6)加入保护剂，冷藏保存。
[0006]所述PBS缓冲液pH值为7.4。
[0007]所述溶解荧光素酶，使荧光素酶浓度为1.5-2mg/mlo
[0008]所述活化生物素使用DCC/NHS和有机溶剂，生物素、DCC和NHS的摩尔比为2:3: 3，有机溶剂为二甲基甲酰胺，纯度为分析纯以上。
[0009]所述搅拌温度为4°C，持续5小时以上，优选为8小时。
[0010]所述透析过程温度为4°C，持续12小时以上，优选为18小时。
[0011]所述透析过程，PBS缓冲液体积为混合溶液的10倍以上，PBS缓冲液更换一次以上。
[0012]所述保护剂含有PBS缓冲液；还含有甘氨酸、组氨酸、甘露醇、DTT、EDTA、叠氮钠和聚乙二醇中的一种或几种。
[0013]所述保护剂优选含有PBS缓冲液、甘氨酸、组氨酸、DTT、EDTA和叠氮钠。
[0014]本发明中二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂能够使生物素和荧光素酶溶解于其中，在其中高效、充分的结合。制备得到的生物素化荧光素酶，非常适合应用于焦磷酸测序反应中，荧光素酶的高活性可确保测序反应的准确度。在测序反应中，可与焦磷酸酶和ATP硫化酶协同作用，进行通量高、读长大的测序反应。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
(1)使用PH7.4的PBS缓冲液溶解荧光素酶，荧光素酶浓度为1.8mg/ml ；
(2)活化生物素:将Imol生物素，1.5mol DCC, 1.5mol NHS加入IL分析纯的二甲基甲酰胺中，进行生物素的活化；
(3)将活化的生物素0.24mol溶于由10ml 二甲基甲酰胺和80ml四氢呋喃混合得到的混合溶剂中，加入荧光素酶0.0lmol，混合，搅拌8小时，温度为4°C，得到混合溶液；
(4)使用ILPBS缓冲液对10ml混合溶液进行透析，持续18小时，温度为4°C，去除杂质和游离生物素，PBS缓冲液在6小时更换一次；
(5)使用280nm的吸光度测定蛋白含量；
(6)加入酶体积2倍的保护剂，保护剂含有1mMPBS缓冲液、20%甘氨酸、30%组氨酸、0.15mM DTT,0.08mM EDTA 和 0.06mM 叠氮钠，冷藏保存。
[0016]实施例2
(1)使用PH7.4的PBS缓冲液溶解荧光素酶，荧光素酶浓度为1.5mg/ml ；
(2)活化生物素:将Imol生物素，1.5mol DCC, 1.5mol NHS加入分析纯的二甲基甲酰胺中，进行生物素的活化；
(3)将活化的生物素0.22mol溶于二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂中，加入荧光素酶0.0lmol，混合，搅拌5小时，温度为4°C，得到混合溶液；
(4)使用ILPBS缓冲液对80ml混合溶液进行透析，持续12小时，温度为4°C，去除杂质和游离生物素，PBS缓冲液在4小时更换一次；
(5)使用280nm的吸光度测定蛋白含量；
(6)加入酶体积1.5倍的保护剂，保护剂含有1mM PBS缓冲液和0.1mM DTT，冷藏保存。
[0017]实施例3
(1)使用PH7.4的PBS缓冲液溶解荧光素酶，荧光素酶浓度为1.6mg/ml ；
(2)活化生物素:将Imol生物素，1.5mol DCC, 1.5mol NHS加入分析纯的二甲基甲酰胺中，进行生物素的活化；
(3)将活化的生物素0.25mol溶于二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂中，加入荧光素酶0.0lmol，混合，搅拌6小时，温度为4°C，得到混合溶液；
(4)使用ILPBS缓冲液对90ml混合溶液进行透析，持续15小时，温度为4°C，去除杂质和游离生物素，PBS缓冲液在4小时和8小时更换；
(5)使用280nm的吸光度测定蛋白含量；
(6)加入酶体积2倍的保护剂，保护剂含有1mMPBS缓冲液、20%甘氨酸、0.2mM甘露醇、0.15mM DTT 和 0.08mM EDTA，冷藏保存。
[0018]实施例4
(1)使用PH7.4的PBS缓冲液溶解荧光素酶，荧光素酶浓度为2mg/ml ；
(2)活化生物素:将Imol生物素，1.5mol DCC, 1.5mol NHS加入分析纯的二甲基甲酰胺中，进行生物素的活化；
(3)将活化的生物素0.23mol溶于二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂中，加入荧光素酶0.0lmol，混合，搅拌7小时，温度为4°C，得到混合溶液；
(4)使用ILPBS缓冲液对85ml混合溶液进行透析，持续13小时，温度为4°C，去除杂质和游离生物素，PBS缓冲液在2小时和9小时更换；
(5)使用280nm的吸光度测定蛋白含量；
(6)加入与酶等体积的保护剂，保护剂含有1mMPBS缓冲液、25%甘氨酸、0.15mM DTT和0.2mM聚乙二醇，冷藏保存。
【主权项】
1.一种生物素化荧光素酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)使用PBS缓冲液溶解荧光素酶； (2)活化生物素； (3)将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂中，加入荧光素酶，按照生物素与荧光素酶摩尔比(22-25):1的比例混合，搅拌，得到混合溶液； (4)使用PBS缓冲液对混合溶液进行透析，去除杂质和游离生物素； (5)使用280nm的吸光度测定蛋白含量； (6)加入保护剂，冷藏保存。2.如权利要求1所述的生物素化荧光素酶的制备方法，其特征在于，所述PBS缓冲液PH值为7.4。3.如权利要求1所述的生物素化荧光素酶的制备方法，其特征在于，所述溶解荧光素酶，使荧光素酶浓度为1.5-2mg/ml。4.如权利要求1所述的生物素化荧光素酶的制备方法，其特征在于，所述活化生物素使用DCC/NHS和有机溶剂，生物素、DCC和NHS的摩尔比为2:3: 3，有机溶剂为二甲基甲酰胺，纯度为分析纯以上。5.如权利要求1所述的生物素化荧光素酶的制备方法，其特征在于，所述搅拌温度为40C，持续5小时以上，优选为8小时。6.如权利要求1所述的生物素化荧光素酶的制备方法，其特征在于，所述透析过程温度为4°C，持续12小时以上，优选为18小时。7.如权利要求1所述的生物素化荧光素酶的制备方法，其特征在于，所述透析过程，PBS缓冲液体积为混合溶液的10倍以上，PBS缓冲液更换一次以上。8.如权利要求1所述的生物素化荧光素酶的制备方法，其特征在于，所述保护剂含有PBS缓冲液；还含有甘氨酸、组氨酸、甘露醇、DTT、EDTA、叠氮钠和聚乙二醇中的一种或几种。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及生物素化荧光素酶的制备方法。包括以下步骤：（1）使用PBS缓冲液溶解荧光素酶；（2）活化生物素；（3）将活化的生物素溶于混合溶剂中，加入荧光素酶，搅拌；（4）使用PBS缓冲液对混合溶液进行透析（5）使用280nm的吸光度测定蛋白含量；（6）加入保护剂，冷藏保存。得到的生物素化荧光素酶生物活性高。
【IPC分类】C12N9/02
【公开号】CN104928264
【申请号】CN201510417159
【发明人】高静, 蔡亦梅, 徐潇, 吴超, 张睿, 王者馥, 王绪敏, 殷金龙, 任鲁风
【申请人】北京中科紫鑫科技有限责任公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年7月16日