一种禾本科植物中通用的snp分型探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域和核酸检测领域，具体设计一种用于禾本科植物SNP 分型的通用Taqman探针及其在禾本科植物SNP位点分型中的应用。
【背景技术】
[0002] 禾本科植物是被子植物中最有经济价值的一大类，约有650多属，10000余种，其 中我国约有200余属，1200多种。禾本科植物是人类粮食和牲畜饲料的主要来源，具有较高 的生态及观赏价值，也是工业的重要原料。
[0003] 以小麦为例，小麦是我国第二大粮食作物，2013年我国小麦产量达到1.2193亿 吨。小麦产量稳定增长和品质不断改良对保障国家粮食安全具有重要的意义。产量高、品 质好和抗病性优的小麦品种是小麦育种的终极目标，分子标记辅助选择已成为小麦常规育 种的重要组成部分，SNP作为一种重要的分子标记，在小麦遗传育种中发挥着越来越重要的 作用。
[0004] 单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指在基因组水平上 由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。与其它分子标记比较，SNP具有位点多、分 布均匀等优点使SNP作为分子标记得以广泛应用。Taqman探针法是SNP检测中常用的一种 方法，其检测原理是应用一对双标记Taqman探针，分别针对双等位SNP的不同基因型，只有 完全匹配的探针才能扩增出各自对应的基因型；用两种荧光染料Fam，Hex(Vic)分别标记 这两种探针，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。Taqman探针法 与其它SNP检测方法相比较，具有灵活性大、精确度灵敏度高和操作简单快速等明显的优 点。
[0005] 但是目前依据Taqman探针法原理，每鉴定一个SNP位点就需合成一对特异性 探针，对于待检测SNP位点较多的情况下，整体用于合成探针的费用很高，一般很难采用 Taqman探针法做SNP分型。这个因素严重限制了 Taqman探针法在SNP检测中的应用。
【发明内容】
[0006] 针对上述Taqman探针法存在的问题，本发明旨在通过一种SNP分型通用Taqman 探针的设计，改进现有Taqman探针法，降低实验成本。
[0007] 对原有Taqman探针的改进思路是：提出通过引物去识别SNP位点，而不是原 Taqman方法中的探针。PCR反应体系中一共有三条引物：一条普通引物，两条分型引物。分 型引物3'端最后一个核苷酸位点是要检测的SNP位点，在其5'端加一段接头核苷酸序列， 而探针的序列和分型引物的接头序列相同。这样不论检测多少个SNP位点，只需设计一对 与分型引物接头序列相同碱基的探针，探针与普通引物的扩增子结合后，探针报告荧光集 团与淬灭基团分开发出荧光，检测进而确定基因型信息，其原理如图1所示。
[0008] 具体地，本发明涉及以下各项：
[0009] 本发明提供通用的SNP分型探针，其序列为SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4,其中，SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3的5'端标记有报告荧光基团， SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4的3'端标记有淬灭荧光基团。
[0010] 在优选的实施方案中，所述报告荧光基团选自FAM、HEX或VIC ;所述淬灭荧光基团 选自 BHQl、TAMRA 或 Eclipse。
[0011] 本发明还提供所述SNP分型探针用于禾本科植物SNP检测的用途。
[0012] 在优选的实施方案中，所述禾本科植物选自小麦、水稻、玉米、青稞、燕麦、黑麦、高 粱、竹子。
[0013] 本发明还提供一种禾本科植物SNP的检测方法，所述方法包括如下步骤：1)设计 3'端为待检测SNP核苷酸的分型引物，所述分型引物在与模板互补序列的5'端包含接头序 列，所述接头序列与权利要求1所述探针的核苷酸序列相同；2)用所述分型引物和与模板 链非SNP区互补的普通引物扩增；3)使用所述探针检测，所述探针与步骤2)的扩增子结合 后，探针的报告荧光集团与淬灭荧光基团分开从而发出荧光，检测进而确定基因型信息。
[0014] 在优选的实施方案中，所述探针和引物浓度比为1:2,所述引物包括所述分型引物 和所述普通引物。
[0015] 在优选的实施方案中，标记有报告荧光发光基团探针与标记有淬灭荧光基团探针 浓度比为7:8。
[0016] 在优选的实施方案中，所述普通引物与所述分型引物间浓度比为8:1。
[0017] 在优选的实施方案中，所述禾本科植物选自小麦、水稻、玉米、青稞、燕麦、黑麦、高 粱、竹子。
[0018] 所述SNP分型探针为小麦中SNP分型相关的分子标记，其可在小麦甚至禾本科植 物中通用检测几乎全部SNP位点。
[0019] PF:5'-CCAGCCTTCCTGAGTAGTGAT-3'（SEQ ID NO :1);
[0020] PBF:5,-ATCACTACTCAGGAAGGCTGG-3'（SEQ ID NO :2);
[0021] PV:5'-TAGATGAGTCGCAGCGTTAGA-3'（SEQ ID NO :3);
[0022] PBV:5'-TCTAACGCTGCGACTCATCTA-3'（SEQ ID NO :4)。
[0023] 序列表中SEQ ID NO :1命名为PF，由21个碱基组成，该序列在NCBI数据库中进行 了检索，在小麦中未发现有同源区段，其5'端标记有报告荧光基团Fam。序列表中SEQ ID NO :2命名为PBF，由21个碱基组成，该序列与SEQ ID NO :1反向互补，其3'端标记有淬灭 荧光基团BHQ1。序列表中SEQ ID NO :3命名为PV，由21个碱基组成，该序列在NCBI数据 库中进行了检索，在小麦中未发现有同源区段，其5'端标记有报告荧光基团Vic。序列表中 SEQ ID NO :4命名为PBV，由21个碱基组成，该序列与SEQ ID NO :3反向互补，其3'端标记 有淬灭荧光基团BHQl。本发明中发光和淬灭基团分别在两条反向互补的寡核苷酸序列上， 这种设计的特点是荧光淬灭效果好，荧光本底值比较低。双链探针分开后即可检测到荧光 信号，继而进行分型判定。
[0024] 与经典Taqman探针反应体系相比较，改进后的反应体系中包含有四条探针和三 条引物，反应体系组分较多需要对其进行优化。优化主要针对探针和引物在反应体系中的 浓度比，包括探针自身浓度比及普通引物与分型引物间浓度比。确定的最终反应体系如表 1所示：
[0025] 表1 :PCR反应体系
[0026]
[0027] PCR反应条件可采用两步法和touchdown法，touchdown法适用于扩增效率不高的 情况，一般扩增两步法即可。两步法扩增条件为：94°C预变性3min ;94°C变性30sec，55°C 退火30sec，共40个循环。Touchdown法扩增条件为：94°C预变性15min ;94°C变性20sec， 61°C退火60sec，以后每个循环依次降低0. 6°C，直到55°C，共10个循环；94°C变性20sec， 55°C退火26sec，共26个循环。
[0028] 本发明的有益效果为：通过对原Taqman探针法的改进，降低了实验成本，使 Taqman探针法能被广泛应用于小麦SNP分型检测中。
【附图说明】
[0029] 图1本发明的SNP检测方法的原理图
[0030] 图2实施例中的扩增产物电泳图
【具体实施方式】
[0031] 通过以下实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明，但以下描述不对本发 明的保护范围构成任何意义上的限定。
[0032] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物和探针由英潍捷基 (上海）贸易有限公司合成。
[0033] 1、选取具有两种基因型的小麦GW2-6A基因序列区段，目标位点上具有C/T两种碱 基，分别见序列表SEQ ID N0:5(844bp)和SEQ ID N0:6(823bp)。将这个片段扩增纯化后 连接到T载体上，进行转化，摇菌提取质粒，最终得到仅具有一个SNP位点差异的WS和0S5 质粒，WS质粒目标位点上是C基因型，0S5质粒是T基因型，将其作为分型对象。
[0034] 2、根据WS和0S5位点信息，分别设计两条分型引物与一条普通引物：
[0035] 分型引物 I :CCAGCCTTCCTGAGTAGTGATCTTTTGAGCAACCAACGC(序列表中 SEQ ID NO : 7) ；
[0036] 分型引物 2 :TAGATGAGTCGCAGCGTTAGACTITTGAGCAACCAACGT (序列表中 SEQ ID NO : 8) ；
[0037] 普通引物：AGCCATAGCAGCAACAGC(序列表中 SEQ ID NO :9);
[0038] PCR 反应体系为：质粒模板 DNA 25ng，dNTP 0.25mmol/L，10Xbuffer，2.0yL，Taq DNA聚合酶0· 5U，分型引物1和2浓度0· 025 μ mol/L，普通引物浓度0· 2 μ mol/L，发光探针 (PB与PV)浓度0· 175 μ mol/L，淬灭探针（PBF和PBV)浓度0· 2 μ mol/L，总体积为20 μ L。 反应程序为：94°C预变性3min ;94°C变性30sec，55°C退火30sec，共40个循环。
[0039] PCR扩增产物的凝胶电泳分析：分别取扩增产物3ul和1 μ I Loading buffer，将 混合物在I. 5%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，凝胶经EB染色后用凝胶成像系统进行观察照 相。确定有IlObp目的条带（见图2)。
[0040] 3、检测荧光强度：
[0041] 用固定激发波长激发，固定发射波长检测：Fam :Ex = 492nm, Em = 520nm ;Vic:Ex =538nm, Em = 554nm。每个样品重复扫三遍，取其平均值。依据两处读值来判定待测质粒 的基因型，WS与0S5在492nm和520nm处荧光读值见下表。
[0042] 表2 :PCR扩增后荧光读值
[0043]
【主权项】
1. 通用的 SNP 分型探针，其序列为 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4,其中，SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :3标记有报告荧光基团，SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :4标记有淬灭荧光基团。2. 根据权利要求1所述的SNP分型探针，所述报告荧光基团选自FAM、HEX或VIC ;所述 淬灭荧光基团选自BHQ1、TAMRA或Eclipse。3. 权利要求1或2所述SNP分型探针用于禾本科植物SNP检测的用途。4. 根据权利要求3所述的用途，所述禾本科植物选自小麦、水稻、玉米、青稞、燕麦、黑 麦、高粱、竹子。5. -种禾本科植物SNP的检测方法，所述方法包括如下步骤： 1) 设计3'端为待检测SNP核苷酸的分型引物，所述分型引物在与模板互补序列的5' 端包含接头序列，所述接头序列与权利要求1所述探针的核苷酸序列相同； 2) 用所述分型引物和与模板链非SNP区互补的普通引物进行扩增； 3) 使用权利要求1所述探针检测，所述探针与步骤2)的扩增子结合后，探针的报告荧 光集团与淬灭荧光基团分开从而发出荧光，检测进而确定基因型信息。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述探针和引物浓度比为1:2,所述引物包括分型 引物和普通引物。7. 根据权利要求5所述的方法，其中标记有报告荧光发光基团探针与标记有淬灭荧光 基团探针浓度比为7:8。8. 根据权利要求5所述的方法，其中所述普通引物与所述分型引物间浓度比为8:1。9. 根据权利要求6-8任一项所述的方法，所述禾本科植物选自小麦、水稻、玉米、青稞、 燕麦、黑麦、高粱、竹子。
【专利摘要】本发明涉及一种禾本科植物中通用的SNP分型探针，所述探针由两对各自反向互补的寡核苷酸序列组成，报告荧光基团和淬灭荧光基团分别位于反向互补的寡核苷酸链上。通过所述SNP分型通用Taqman探针的设计，改进现有Taqman探针法，降低实验成本，使Taqman探针SNP分型法能被广泛应用于禾本科植物SNP检测中。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104946748
【申请号】CN201510290157
【发明人】刘瑞娟, 刘宝龙, 刘迪, 车国冬, 蔡振媛
【申请人】中国科学院西北高原生物研究所
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月1日