一种以fmyyssr-4标记对烟草原料进行鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学研宄领域，具体是一种以FMYYSSR-4标记（即分子标记技 术）对烟草原料进行鉴定的方法，由于本方法以烟草物种DNA的特异性作为鉴定依据，因此 与传统鉴定方法相比，有更加客观、更加准确、更加可靠的优势。
【背景技术】
[0002] 在烟草原料的鉴别检验工作中，多是通过外观判断、评吸等手段进行烟草原料鉴 定，个别烟草原料鉴别检验涉及相关的化学成分检测。但就目前来看，部分形态的烟草原料 (如烟丝、烟沫等)，很难从外观上进行鉴别检验，烟草与其他植物之间、各烟草种类之间也 很难完全以化学成分检测及评吸来进行鉴别；而且上述鉴别要求检验人员不仅需要掌握相 关的原料特性、化学成分分析方法、感官评吸技术，还需具备烟草原料生产和分级技能，检 验人员的培训难度大；另外，烟草原料本身的霉变和不法分子所采取的染色、加香加料等手 段，也加大了检验人员进行准确鉴定的难度。
[0003]DNA分子标记技术属于分子生物学研宄范畴，是从DNA水平区分不同物种甚至是 同一物种不同个体之间的选择性标记技术[1_ 7]。自上世纪80年代以来，随着聚合酶链式 反应（PCR)技术的出现，DNA分子生物学研宄发展迅猛，目前DNA分子标记技术已有数十 种之多，如限制性片段长度多态性标记（RestrictionFragmentLengthpolymorphism, RFLP)[8]、随机扩增多态性标记（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAH))?、序列特异 性扩增区域标记（SequenceCharacterizedAmplifiedRegions,SCAR)[1°]、内含子长度多 态性标记（intron-lengthpolymorphism,ILP)[n]、单核苷酸多态性（SingleNucleotide Polymorphism，SNP)[12]、简单序列重复标记（SimpleSequenceRepeats,SSR)[13]等。由于 在DNA分子水平，不同物种间甚至是同一物种不同个体之间都能得到很好的区分，因此DNA 分子标记技术作为物种分类鉴定的一种手段，已被广泛地应用于属间、种间、品种间的分类 鉴定和亲缘关系研宄中，几乎可以对所有的生物种类进行分类鉴定 [14_24]，在目前物种鉴定 技术中发展最快，也最为热门。表1列出了DNA分子标记技术在各类鉴定中的应用。
[0004] 表1DNA分子标记技术在各类鉴定中的应用
目前的烟草原料鉴别检验技术，以样品的外观、口感及化学成分特征为基础，只能外 在、间接地反映烟草物种的特性，导致目前的鉴别检验易受外界环境、检验人员主观感受 差异、加工条件及烟草本身器官组织变化等因素的影响，准确性、可靠性有较大局限；而以 DNA分子标记技术进行烟草原料鉴定，是以烟草基因组序列信息为基础，可内在、直接地反 映烟草的特性，以其进行鉴别检验不受上述诸多因素的影响。因而以DNA分子标记技术来 对烟草原料进行鉴定，无疑将会更加准确、可靠。
[0005] 中国专利公开了云南红云红河集团申报的一种应用SSR分子标记技术鉴定商品 卷烟的方法，通过识别单品种或混合品种的特征条带，掌握所鉴定样品的原料品种组成，达 到辨别真伪的目的。
[0006] 随着基因组学的迅速发展，越来越多的动植物基因组已经被测序出来。迄今为 止，在前科里，已有栽培番前（Solanumlycopersicum)，马铃薯（Solanumtuberosum)， 辣椒（Capsicumannuum)，本氏烟（Nicotianabenthamiana)，潘那利番前（Solanum pennellii)，野生醋栗番前（Solanumpimpinellifolium)，（Nicotianatabacum)等的基因 组序列或基因组草图被公布出来。这为我们开发烟草特异的分子标记提供了可能。作为面 向市场和应用、具有权威性和法律效应的鉴定技术，必须准确可靠，简单易行。基于SSR的 分子标记，通过PCR扩增和凝胶电泳就可较为方便的完成样品检测。而其他基于SNP等的 分型手段，还必须经过sanger测序等一系列方式，增添不必要的成本和步骤。
[0007]
【发明内容】
[0008] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供的一种以FMYYSSR-4标记对烟 草原料进行鉴定的方法。
[0009] 本发明的研宄过程及原理在于：广泛收集了目前在烟草中已经开发和发表的SSR 标记，作为筛选和过滤的基础。具体分析步骤包括：1、取拟南芥、本氏烟（国际上普遍采用 的一种模式烟草种，与普通烟草亲缘关系较近）、栽培烟草、番茄和土豆作为参考序列，将候 选标记进行比对；2、过滤掉能和拟南芥、番前和土豆能比对上的SSR标记。3、选取能和本氏 烟、栽培烟草均能比对上，且扩增序列单一的SSR标记。4、筛选的标记扫描美国国立生物技 术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI)数据库的所有物种 基因序列信息，验证上述引物在烟草中的特异性。经过筛选，最终确定以FMYYSSR-4标记， 对样品是否为烟草进行鉴定。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 一种以FMYYSSR-4标记对烟草原料进行鉴定的方法，在以十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)法，对各个品种标准烟草样品的DNA进行提取后，以所设计的引物对其进行PCR扩 增，在经过电泳分析后，确定烟草物种的特异性条带位置；再以同样的方法对样品进行处理 后，视其在相应位置有无条带产生来判断该样品是否为烟草，具体步骤如下： 1) FMYYSSR-4标记的引物设计，上下游引物序列分别为CGTGCTCAAGGACATTCTCA和 CTGCAGCTCCAATCCAGAAT； 2) 烟草样品及待测样品DNA提取：（1)取不同样品分别将其组织碾磨成细粉末，放入2 mL离心管中。（2)加入600~800yL的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65°C水浴预热)，每 3~5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min离心10~15min。（3)小心吸取上清液，加 入等体积的苯酷：氯仿(各400yL)溶液，混勾，4 °C，12000r/min，离心10~15min;(4)小 心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混勾，4 °C，12000r/min，离心10~15min，重复2~3次， 以蛋白层不出现为止。（5)取上清，-20 °C沉淀1~2h，4 °C，12000r/min，离心10~15min; (6)弃去上清液，用50%~70%乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥后（一般干燥10~15min)， 于-20 °C或者-70 °C下保存备用。
[0011] 3)PCR反应按以下程序进行：解链温度95°C，30秒，退火温度55°C，30秒，延伸温 度68 °C，30秒，重复35个循环。
[0012] 4)取25yL的PCR产物凝胶电泳分析，在确定烟草物种的特异性条带位置后，视 样品在相应位置有无条带产生来判断该样品是否为烟草。结果如图1所示。从电泳结果可 以看出，所有烟草样品均能扩出明显的特异性条带(约200bp处)，该条带在样品1-4中均 能扩出，在样品5-8中均未见扩出。这说明样品1-4为烟草，样品5-8为非烟草。
[0013] 本发明相比现有技术的优点在于：本方法以烟草物种DNA的特异性作为鉴定依 据，因此与传统鉴定方法相比，有更加客观、更加准确、更加可靠的优点。
[0014] 本发明与云南红河集团所申报专利的具体区别体现在以下几点： 1.本发明的SSR标记在设计时经过了严谨的生物信息学分析，针对烟草物种的特异位 点进行引物设计，这与云南的专利申报内容有着本质区别。
[0015] 2.本发明所设计的引物与云南专利所设计的引物序列不同。我们引物设计的出 发点，是为了满足烟草原料鉴别检验工作的需求，具体来说，我们设计的引物是为了鉴定待 测样品是否为烟草样品，这与云南专利的用途方面有着显著差异。
[0016] 3.本发明设计的SSR标记与云南专利的SSR标记用途不同：云南专利所设计的 SSR标记用于商品卷烟的真假判定；我们所设计的SSR标记用于烟草与非烟草样品的判定， 这在涉案烟草原料的处理中非常重要。
【附图说明】
[0017] 图1.烟草鉴定DNA分子标记FMYYSSR-4的扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果， 图中：1.K326;2.云烟97;3.林烟草；4.绒毛状烟草；5.样品1;6.样品2;7.样品 3 ;8?样品 4 ;9?样品 5 ;10?样品 6 ;11?样品 7 ;12?样品 8 ;M，trans2KDNAmarker。
【具体实施方式】
[0018] 本发明以下结合实施例做进一步描述： 实施例1 1.FMYYSSR-4标记的引物设计。上下游引物序列分别为CGTGCTCAAGGACATTCTCA和CTGCAGCTCCAATCCAGAAT〇
[0019] 2.烟草样品及待测样品DNA提取：⑴取不同样品分别将其组织碾磨成细粉末， 放入2mL离心管中。（2)加入600yL的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65°C水浴预热)， 每3min轻轻震荡几次，20min后12000r/min离心10min。（3)小心吸取上清液，加入等 体积的酚：氯仿(各400yL)溶液，混匀，4 °C，12000r/min，离心10min; (4)小心吸取上 清液，加入等体积的氯仿，混勾，4 °C，12000r/min，离心10min，重复2次，以蛋白层不出现 为止。（5)取上清，-20 °C沉淀1h，4 °C，12000r/min，离