一种卵黄降脂肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种降脂肽的制备方法，特别是关于一种卵黄降脂肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]我国是农业大国，畜产品资源非常丰富，禽蛋在畜产品总量中占有相当大的比重。禽蛋作为人们日常生活中餐桌的必备佳肴，传统的禽蛋主要用于烹饪、生产蛋白粉和蛋黄粉等，许多活性物质没有得到充分利用。鸡蛋生产主要以食用为主，因蛋黄中含有较高的胆固醇，在某种程度上限制了食用消费量的大幅度增加；同时，现在的蛋品深加工未能形成规模，加工产品非常单一，技术含量也不高，规模化生产程度不高，品种有限；卵黄中含有丰富的脂质，对其蛋白的提取纯化利用难度较大，成本偏高。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是:提供一种卵黄降脂的制备方法，使其制出的卵黄降脂肽纯度高。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明包括下列步骤:
I)将卵黄蛋白粉溶入去离子水中，底物浓度为10%，采用复合风味蛋白酶酶解。
[0005]2)采用超滤技术对卵黄蛋白质水解液进行分离，收集分子量小于10000的多肽液，冷冻干燥后得卵黄降脂肽粗提取物。
[0006]对所述粗提物进行以下纯化步骤，可得到纯化的猪血抗菌肽精制品:
I)冷冻干燥所述卵黄降脂肽的粗提物，并将所述粗提物过凝胶型阳离子交换柱，对交换柱进行洗脱，收集洗脱液；得到4个级分，它们的分子量分布为5810D的EYP-1、1330D的EYP-2、897D 的 EYP-3 和 557D 的 EYP-4。
[0007]2)将EYP-4利用高效逆流色谱(HSCCC)进行单体制备，EYP-4经HSCCC制备分离得到的三个组分。
[0008]在上述过程中，卵黄蛋白粉与复合风味蛋白酶的重量份数之比为100:1?3 ;酶解的温度为45-55°C，pH6.5，酶解的时间为3?6h。
[0009]冷冻干燥卵黄蛋白降脂肽粗提物的温度为-50?60°C，冷冻时间为24h?48h。
[0010]凝胶型阳离子交换柱为Sephadex G_25凝胶层析柱，上样浓度30mg/ml，上样量2.6ml，流速1.3ml/min，以含有NaCl0.25mol/L的重蒸水为洗脱液，得到4个级分，它们的分子量分布为 5810D 的 EYP-U1330D 的 EYP-2、897D 的 EYP-3 和 557D 的 EYP-4。
[0011]高效逆流色谱(HSCCC)进行单体制备的条件是:上样浓度为40mg/ml，流动相为聚乙二醇、磷酸盐的水溶液(配制方法为每100ml流动相中含有聚乙二醇150g，磷酸盐170g)，流动相中磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的比例为3:1;ΕΥΡ-4经HSCCC制备分离得到的三个组分，三个组分的氨基酸排列顺序分别为Lys-Glu-Pro-1le、His-1le-Pro-Leu和Lys-Glu-Tyr0
[0012]本发明的原料卵黄蛋白粉的制备包括以下步骤: 脱脂蛋黄粉浓度为30%，乙醇溶液的浓度为45%，pH值为4.4，氯化钠浓度为0.02 mol/L，搅拌提取2小时，离心收集沉淀，冷冻干燥，制成卵黄蛋白粉。
[0013]本发明研宄了卵黄降脂肽的分离纯化技术，并对分离纯化的肽类物质的生物学活性进行了研宄，结果表明:将卵黄降脂肽进行小鼠的体内降血脂研宄，将8组小鼠建立高血脂模型后，灌胃卵黄降脂肽四周，每周对小鼠进行称重。四周后对小鼠进行眼球采血，利用试剂盒检测血清中的胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和肝脂中的胆固醇、甘油三酯和总脂肪量，并计算动脉硬化指数。结果发现多肽液可以明显降低血清中胆固醇和甘油三酯的含量(P < 0.05);降低低密度脂蛋白效果较明显(P < 0.05);明显升高血清中高密度脂蛋白的浓度(P < 0.05)。本发明方法生产的卵黄降脂肽是一种新型的绿色血压血脂调节剂。
[0014]本发明具有以下优点:1、本发明方法实现了从卵黄中提取具有较强降脂作用的多肽物质，为生产降脂肽提供了一个新的途径和方法。2、采用本发明方法生产的降脂肽，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效降脂等特点，是一种新型的降脂调节剂。3、实施本发明方法的原料卵黄来源丰富，价格低廉，可以满足大规模深化加工的需要，具有很强的开发应用推广价值。
【具体实施方式】
[0015]实施例1、
1、脱脂蛋黄粉浓度为30%，乙醇溶液的浓度为45%，pH值为4.4，氯化钠浓度为0.02mol/L，搅拌提取2小时，离心收集沉淀，冷冻干燥，制成卵黄蛋白粉。
[0016]2、将10g卵黄蛋白粉溶入100ml去离子水中，升温至50°C，pH6.5，加入30g复合风味蛋白酶，酶解的时间为4h，升温90°C保温15min灭酶。
[0017]3、采用超滤技术对卵黄蛋白质水解液进行分离，收集分子量小于10000的多肽液，得卵黄降脂肽粗提取物。
[0018]4、采用真空冷冻干燥机，将卵黄降脂肽的粗提物进行常规真空冷冻、干燥(冷冻温度为-50?-60°C，干燥时间为24?48h)，制成卵黄降脂肽粗提物干粉。然后取5g粗提物干粉置于Sephadex G-25凝胶层析柱，上样浓度30mg/ml，上样量2.6ml，流速1.3ml/min，以含有NaCl0.25mol/L的重蒸水为洗脱液，得到4个级分，它们的分子量分布为5810D的EYP-U1330D 的 EYP-2、897D 的 EYP-3 和 557D 的 EYP-4。
[0019]5、采用高效逆流色谱(HSCCC )进行单体制备，上样浓度为40mg/ml，流动相为聚乙二醇、磷酸盐的水溶液(配制方法为每100ml流动相中含有聚乙二醇150g，磷酸盐170g)，流动相中磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的比例为3:1;ΕΥΡ-4经HSCCC制备分离得到的三个组分，三个组分的氨基酸排列顺序分别为Lys-Glu-Pro-1le、His-1le-Pro-Leu和Lys-Glu-Tyr0
[0020]实施例2小鼠体内降血脂的试验
将纯化的HSCCC单体三组分混合物(卵黄降脂肽)进行小鼠的体内降血脂研宄，将8组小鼠建立高血脂模型后，灌胃卵黄降脂肽四周，每周对小鼠进行称重。四周后对小鼠进行眼球采血，利用试剂盒检测血清中的胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和肝脂中的胆固醇、甘油三酯和总脂肪量，并计算动脉硬化指数。结果发现多肽液可以明显降低血清中胆固醇和甘油三酯的含量(P < 0.05);降低低密度脂蛋白效果较明显(P < 0.05);明显升高血清中高密度脂蛋白的浓度(P < 0.05)。
[0021]具体表现为实验组小鼠的体重增长是空白对照组小鼠体重增长的76.79-90.44% ；小鼠血清胆固醇分别是空白对照组的49.68-79.90%，是给药对照组的57.34-92.21% ;血清甘油三酯分别是空白对照组的51.20-87.08%、是给药对照组的75.35-128% ;血清低密度脂蛋白分别是空白对照组的81.66-177%、是给药对照组的80.23-174% ;血清高密度脂蛋白分别是空白对照组的116-140%、是给药对照组的99.40-119% ;动脉硬化指数分别是空白对照组的0.31-55.62%、是给药对照组的0.54-96.74% ;肝脏中胆固醇分别是空白对照组的29.83-92.89%、是给药对照组的53.89-167% ;肝脏中甘油三酯分别是空白对照组的43.10-87.76%、是给药对照组的 47.51-96.73%。
【主权项】
1.一种卵黄降脂肽粗提取物的制备方法，包括以下步骤: 1)将卵黄蛋白粉溶入去离子水中，底物浓度为10%，采用复合风味蛋白酶酶解； 2)采用超滤技术对卵黄蛋白质水解液进行分离，收集分子量小于10000的多肽液，冷冻干燥后得卵黄降脂肽粗提取物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:对所述粗提物进行以下纯化步骤: 1)冷冻干燥所述卵黄降脂肽的粗提物，并将所述粗提物过凝胶型阳离子交换柱，对交换柱进行洗脱，收集洗脱液；得到4个级分，它们的分子量分布为5810D的EYP-1、1330D的EYP-2、897D 的 EYP-3 和 557D 的 EYP-4 ； 2)将EYP-4利用高效逆流色谱(HSCCC)进行单体制备，EYP-4经HSCCC制备分离得到的三个组分； 3)利用纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(Nano-ES1-Ms/Ms)技术进行质谱分析，得到三个组分的氨基酸排列顺序。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述卵黄蛋白粉与所述复合风味蛋白酶的重量份数之比为100:1?3 ;酶解的温度为45-55°C，pH6.5，酶解的时间为3?6h。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于:所述冷冻干燥卵黄蛋白降脂肽粗提物的温度为-50?60°C，冷冻时间为24h?48h。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于:所述凝胶型阳离子交换柱为SephadexG_25凝胶层析柱，上样浓度30mg/ml，上样量2.6ml，流速1.3ml/min,以含有NaCl0.25mol/L的重蒸水为洗脱液，得到4个级分，它们的分子量分布为5810D的EYP-1、1330D的EYP-2、897D的 EYP-3 和 557D 的 EYP-4。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于:利用高效逆流色谱(HSCCC)进行单体制备的条件是:上样浓度为40mg/ml，流动相为聚乙二醇、磷酸盐的水溶液(配制方法为每100ml流动相中含有聚乙二醇150g，磷酸盐170g)，流动相中磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的比例为3:1;ΕΥΡ-4经HSCCC制备分离得到的三个组分，三个组分的氨基酸排列顺序分别为Lys-Glu-Pro-1le、His-1le-Pro-Leu 和 Lys-Glu-Tyr。7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述卵黄蛋白粉的制备包括以下步骤: 脱脂蛋黄粉浓度为30%，乙醇溶液的浓度为45%，pH值为4.4，氯化钠浓度为0.02 mol/L，搅拌提取2小时，离心收集沉淀，冷冻干燥，制成卵黄蛋白粉。
【专利摘要】本发明公开了一种卵黄降脂肽的制备方法，该方法包括以下步骤：1）将卵黄蛋白酶解、超滤、冻干制备卵黄降脂肽的粗提物。2）为了得到卵黄降脂肽的精制品，对所述粗提物进行以下纯化步骤：1）泠冻干燥所述猪血抗菌肽的粗提物，并将所述粗提物过凝胶型阳离子交换柱，对交换柱进行洗脱，收集洗脱液；再高效逆流色谱洗脱液进行单体制备，成为卵黄降脂肽。本发明为生产降脂肽提供了一个新的途径和方法。
【IPC分类】C12P21/06, A61P9/12, C07K1/16, C07K1/34, C07K1/18, A61P3/06
【公开号】CN104975062
【申请号】CN201510488622
【发明人】宁成勇, 宁发子, 邓小玲
【申请人】重庆都好生物科技有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年8月11日