一种再生蚕丝蛋白多肽及其制备和应用
【专利说明】一种再生蚕丝蛋白多肽及其制备和应用
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技术领域
[0002]本发明涉及生物技术多肽制备领域，具体涉及再生蚕丝蛋白多肽制备领域。
技术背景
[0003]蚕丝是熟蚕结茧时所分泌丝液凝固而成的连续长纤维，也称天然丝，是一种天然纤维。人类利用最早的动物纤维之一。
[0004]在蚕丝纤维的制造过程中产生一些废料，如真丝废丝、汰头、茧衣、絹纺下脚料等，这些材料由于强力较低，无法用于织作蚕丝广泛应用于纤维制造业，因而被丢弃，造成了浪费。为了合理利用这些废蚕丝，研宄人员对再生蚕丝蛋白的结构和性能进行了测试分析。结果发现，再生蚕丝蛋白，强度较天然蚕丝小，吸湿能力和抗紫外线性能高于天然蚕丝。再生蚕丝的这些性能改变对蚕丝纤维的制造是非常不利的。
[0005]然而，随着蚕丝的应用领域的拓宽，蚕丝在化妆品领域的功效显得尤为突出。由于蚕丝蛋白质分子特殊的化学结构，具有天然调湿、改善人体皮肤营养、防止皮肤起皱、增强皮肤细胞活力和弹性、促进细胞新陈代谢及维持皮肤正常生理状态的作用。由于，化妆品与纤维制造的需求不同，化妆品需要更高的保湿效果，以及抗紫外线的作用，因此，再生蚕丝比天然蚕丝具有更好的吸湿能力和抗紫外线的特点，如果应用于化妆品领域，有起到更好的保湿和防晒的作用。
[0006]当再生蚕丝蛋白应用于化妆品时，和天然蚕丝蛋白一样存在分子量较大的问题。较大的分子量的蛋白往往会引起过敏反应，导致皮肤瘙痒。小分子蛋白质或多肽就不容易诱发免疫变态反应。但是，小分子蛋白质往往会失去原形蛋白质的功效。因此，如何才能让分解后的蚕丝蛋白小分子既有原蛋白质的功效，且不引起过敏，一直是一个难以协调的冋题。
【发明内容】
[0007]发明目的
针对现有蚕丝蛋白化妆品的现状，发明一种再生蚕丝蛋白多肽及制备和应用，该多肽是利用再生蚕丝制备的多肽，将该多肽应用于化妆品，其与天然蚕丝蛋白相比，具有更好的保湿和防晒效果。同时，降低原料成本。
[0008]技术方案
本发明为一种再生蚕丝蛋白多肽，其序列为LVDDTDRSIGILSGSCAAANV。制备步骤包括
(I)将蚕丝废料500g剪碎后，按照质量/体积=1:1-3加入碳酸氢钠溶液，混匀；(2)将含蚕丝废料的碳酸氢钠溶液在-70-80°C速冻；(3)采用冷冻高速组织匀浆器，将凝固混合物匀浆；(4)匀浆后，煮沸1-2小时；(5)趁热，过滤，取上清；(6)待上清冷却后，调pH值至ρΗ6.0-6.5 ；(7)离心10000-15000rpm, 30-60分钟，得到沉淀物；(8)将沉淀物复溶于pH4.5-5.0缓冲液中，采用固定化酶技术，分解得到分子量为2400-3600Da的多肽，即得。所述的蚕丝废料，其特征在于，可以是真丝废丝、汰头、茧衣、絹纺下脚料等。所述的固定化酶，其特征在于，可以是无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶等。所述的再生蚕丝蛋白多肽，在制备化妆品中的应用。
[0009]本发明多肽也可由上海生工合成，纯度98%。
[0010]有益效果
本发明的制备得到的再生蚕丝蛋白多肽，经蛋白质序列测定，序列为LVDDTDRSIGILSGSCAAANV,纯度大于60%。实验表明，该多肽具有保湿和防晒的作用，作用与天然蚕丝蛋白相比，效果更好。抗原实验结果表明，该多肽没有抗原性。同时，实现废物利用，降低原料成本。
[0011]
【具体实施方式】
[0012]实施例1
将清洗、烘干后的将真丝废丝500g剪碎后，加入500ml碳酸氢钠溶液，混匀；将含真丝废丝的碳酸氢钠溶液在-70-80°C速冻；采用冷冻高速组织匀浆器，将凝固混合物匀浆；匀浆后，煮沸I小时；趁热，过滤，取上清；待上清冷却后，调PH值至pH6.0-6.5 ;离心1000rpm,60分钟，得到沉淀物；将沉淀物复溶于pH4.5-5.0缓冲液中，采用固定化的菠萝蛋白酶，分解得到分子量为2400-3600Da的多肽，即得。采用固相蛋白质自动测序仪测定该多肽的序列为 LVDDTDRSIGILSGSCAAANV，纯度为 68.9%。
[0013]实施例2
将清洗、烘干后的将茧衣500g剪碎后，加入100ml碳酸氢钠溶液，混匀；将含茧衣的碳酸氢钠溶液在-70-80°C速冻；采用冷冻高速组织匀浆器，将凝固混合物匀浆；匀浆后，煮沸2小时；趁热，过滤，取上清；待上清冷却后，调pH值至pH6.0-6.5 ;离心15000rpm，30分钟，得到沉淀物；将沉淀物复溶于PH4.5-5.0缓冲液中，采用固定化的无花果蛋白酶，分解得到分子量为2400-3600Da的多肽，即得。采用固相蛋白质自动测序仪测定该多肽的序列为 LVDDTDRSIGILSGSCAAANV，纯度为 60.1%。
[0014]实施例3
将实施例1制备的多肽添加入乳膏基质中，进行免疫原性检测。BALB/c白鼠6只，雌雄各半，将小鼠背部脱毛，裸露皮肤。分别取不同浓度的再生蚕丝蛋白多肽溶液(0.5，1.0，2.0mg/ml)以1.25 μ L / cm2涂敷密度短期I次涂敷，每日涂敷I次，连续8周，于1-12周眼眶静脉丛定点取血每周一次，12000 rpm离心2 min，分离血楽取上清液，_20°C低温保存备用。待室温溶解后，取0.1 ml上清液间接ELISA检测血清中抗体滴度。以各样品实际A值(0D450)比阴性对照血清A值即得RA值，RA彡2.1即为阳性，将Blood b1-samples样品作一系列稀释后进行检测，呈阳性反应的最高稀释度即为该样品的滴度。测定结果显示。1-12周收集的血样，经ELISA间接法检测多肽诱导抗体均为阴性。由此可见，本发明得到的再生蚕丝蛋白多肽无免疫原性。
[0015]实施例4
将上海生工制备的多肽添加入乳膏基质中。分别取不同浓度的天然蚕丝蛋白2.0mg/ml、再生蚕丝蛋白2.0mg/ml、再生蚕丝蛋白多肽溶液(0.5，1.0，2.0mg/ml)以1.25 μ L /cm2涂敷密度短期I次涂敷，轻轻拍打至吸收，测定12小时后角质层水分含量。数据计算:皮肤水合度变化率(％)=[皮肤水合度(测试时)-皮肤水合度(对照时)]/皮肤水合度(对照时)X 100 %。将实验重复三次，2.0mg/ml天然蚕丝蛋白、2.0mg/ml再生蚕丝蛋白、0.5，1.0,2.0mg/ml再生蚕丝蛋白多肽溶液的皮肤水合度率分别提高了为40.13,53.72,50.35、58.62、64.98%ο
[0016]同时，分别取不同浓度的天然蚕丝蛋白2.0mg/ml、再生蚕丝蛋白2.0mg/ml、再生蚕丝蛋白多肽溶液(0.5，1.0，2.0mg/ml)以1.25 μ L / cm2涂敷密度短期I次涂敷，轻轻拍打至吸收，测定12小时后使用前后表皮的水分经皮肤散失，将实验重复三次。初始对照的透皮失水值分别为 21.3 g / (m2*h)、22.0g/ (m2*h)、20.8 g / (m2*h)、21.7 g /(m2.h )和20.6 g / (m2.h )使用2.0mg/ml天然蚕丝蛋白、2.0mg/ml再生蚕丝蛋白、0.5，
1.0，2.0mg/ml再生蚕丝蛋白多肽溶液至12 h时，透皮失水分别达到16.4 g / (m2.h)、
13.5 g / (m2.h)、13.2 g / (m2.h)、11.4 g / (m2.h)和 10.1 g / (m2.h)，均有不同程度的降低。
[0017]可见，再生蚕丝蛋白多肽溶液能显著性提高皮肤水合度率，有效地降低皮肤的透皮水分蒸发，具有保湿的作用，且与天然普通蚕丝蛋白和再生蚕丝蛋白相比，效果更好。
[0018]实施例5
将上海生工制备的多肽添加入乳膏基质中。选择受试者左、右手臂内侧距手掌基部10公分处为实验部位，左手臂内侧距手掌基部15公分处为对照空白部位。首先使用皮肤黑素和血红素测试仪测定实验部位涂抹化妆品前的黑素含量。每点测五次，取平均值。
[0019]在受试者左手臂实验部位分别涂抹天然蚕丝蛋白2.0mg/ml、再生蚕丝蛋白
2.0mg/ml、再生蚕丝蛋白多肽溶液(0.5，1.0，2.0mg/ml)以1.25 yL / cm2涂敷密度，每天早晚涂抹两次；空白部位不涂抹化妆品。实验期间，受试者在实验部位不能涂抹其它任何化妆品。受试者在连续使用化妆品一周后，使用皮肤黑素和血红素测试仪测试皮肤颜色的变化。计算20名受试者平均黑素值，计算黑色素变化率(％)=[黑色素(测试处)-黑色素(空白处)]/黑色素(空白处)X 100%。结果得到涂抹天然蚕丝蛋白2.0mg/ml、再生蚕丝蛋白2.0mg/ml、再生蚕丝蛋白多肽溶液(0.5，1.0,2.0mg/ml)处黑色素变化率分别为54.06、35.53,32.65,24.98,25.53%。可见，再生蚕丝蛋白多肽溶液具有防晒的作用，且与天然蚕丝蛋白和再生蚕丝蛋白相比，防晒效果更好。
【主权项】
1.一种再生蚕丝蛋白多肽，其特征在于，序列为LVDDTDRSIGILSGSCAAANV。2.根据权利要求1所述再生蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤包括(I)将蚕丝废料500g剪碎后，按照质量/体积=1:1-3加入碳酸氢钠溶液，混匀；(2)将含蚕丝废料的碳酸氢钠溶液在-70-80°C速冻；(3)采用冷冻高速组织匀浆器，将凝固混合物匀浆；(4)匀浆后，煮沸1-2小时；(5)趁热，过滤，取上清；(6)待上清冷却后，调pH值至pH6.0-6.5 ；(7)离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；(8)将沉淀物复溶于pH4.5-5.0缓冲液中，采用固定化酶技术，分解得到分子量为2400-3600Da的多肽，即得。3.根据权利要求书2再生蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的蚕丝废料是真丝废丝、汰头、茧衣、絹纺下脚料。4.根据权利要求书2再生蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的固定化酶是无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶。5.根据权利要求书I所述的再生蚕丝蛋白多肽在制备化妆品中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种再生蚕丝蛋白多肽，涉及生物技术多肽制备领域。其序列为LVDDTDRSIGILSGSCAAANV。制备步骤包括（1）将蚕丝废料500g剪碎后，按照质量/体积=1:1-3加入碳酸氢钠溶液，混匀；（2）将含蚕丝废料的碳酸氢钠溶液在-70-80℃速冻；（3）采用冷冻高速组织匀浆器，将凝固混合物匀浆；（4）匀浆后，煮沸1-2小时；（5）趁热，过滤，取上清；（6）待上清冷却后，调pH值至pH6.0-6.5；（7）离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；（8）将沉淀物复溶于pH4.5-5.0缓冲液中，采用固定化酶技术，分解得到分子量为2400-3600Da的多肽。所述的再生蚕丝蛋白多肽，在制备化妆品中的应用。本发明制备的再生蚕丝蛋白多肽，纯度大于60%。该多肽具有保湿和防晒的作用，作用与天然蚕丝蛋白相比，效果更好，且原料成本低。
【IPC分类】C07K14/435, A61Q17/04, C12P21/06, A61Q19/00, A61K8/64
【公开号】CN104987373
【申请号】CN201510449668
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月28日