一种利用小球藻蛋白提取生物活性多肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物化工领域，特别涉及一种利用小球藻蛋白提取生物活性多肽的方 法。
【背景技术】
[0002] 小球藻（Chlorella spp.)是一类普生性单细胞绿藻，属于绿藻门 (Chlorophyta)，绿藻纲（Chloro-phyceae)，绿藻目（Chlorococcales)，卵囊藻科 (Oocys一taceae)，小球藻属（Chlorellapyrenoidosa) t。小球藻体内含有丰富的生物活性 物质，如不饱和脂肪酸、色素、蛋白质等，具有抗肿瘤、抗菌和抗病毒，防治消化性溃疡和缺 铁性贫血、抗高脂血症和动脉粥样硬化、抗辐射、解毒保肝和降低血压等多种功能。通常蛋 白质含量较高（55% -67% )，其次是糖类（15% -10% )，并含有具有生物活性的藻多糖、植 物生长因子、（ChlorellaGrowth Factors，CGF)、糖蛋白、糖脂蛋白、膳食纤维等。近年来的 研究发现，人类摄取蛋白质经消化酶作用后，并非主要以氨基酸的形式吸收，而是以肽的形 式吸收。目前已有从螺旋藻和其他微藻蛋白的水解物中成功提取具有生理活性的多肽的报 道，但对富含蛋白质的小球藻加工制备生物活性多肽的工艺相关的报道还较少。已知的研 究只有利用酶解法制备小球藻生物多肽的研究（钟秋平，林美芳，戴梓茹等.酶解小球藻 蛋白制备多肽的工艺研究[J].食品研究与开发，2014, 6(35) :53-55)，该研究发现利用酶 解法制备生物活性肽，不仅可以提高蛋白质的溶解性，降低小球藻中的不良腥味等负面影 响，而且营养成分缺失少。在该工艺中小球藻细胞壁是提取生物多肽最关键的一个因素，采 用超声波破碎法，设备昂贵、增加生产成本，同时采用酶法提取，多肽富集液纯度较低，因此 不适用于大规模工业应用。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是：对于上述现有技术的不足，提供一种利用小球藻 蛋白提取生物活性多肽的方法。
[0004] 本发明一种利用小球藻蛋白提取生物活性多肽的方法，其提取方法具体步骤如 下：
[0005] 1、破壁：配制浓度为8% -10%的小球藻混悬液，经_20°C冷冻，后室温下解冻。重 复冻融过程4次，每次冷冻12h ;
[0006] 2、小球藻蛋白提取：将步骤1中冻融完成小球藻混悬液置于磁力搅拌仪2. 5h、后 低温（-2°C )离心10min,转速控制2000_2500r/min，取上清液；
[0007] 3、生物多肽提取：将步骤2中含有小球藻蛋白上清液配制200ml浓度为2g/L溶 液，调节PH为8. 5,置于泡沫分离器中，调节空气流速为50ml/min、待泡沫产生开始计时 20min，后立即停止通气，收集泡沫、冷冻（-KTC )真空干燥，即得多肽提取液。
[0008] 进一步，步骤3中所述优选采用柠檬酸缓冲液调节pH为8. 5。
[0009] 泡沫分离技术是根据表面吸附的原理，通过向溶液通气产生泡沫并形成泡沫层， 通过吹气将泡沫层带出容器，从而将泡沫层与液相主体分离。表面活性物质聚集在泡沫层 内，由于蛋白质和多肽都是表面活性物质，在通气情况下容易产生泡沫并形成泡沫层通过 气泡分离就可以达到浓缩表面活性物质目的。
[0010] 本发明的有益效果：本发明采用泡沫分离法与传统酶法、超临界萃取技术相比，设 备简单，易操作，而且环保，提取得到的多肽液纯度高，适用于工业化应用。同时经本发明的 方法小球藻蛋白生物活性多肽提取率范围为16. 525% ±0. 2%。
【附图说明】
[0011] 图1为牛血清蛋白溶液标准曲线图
【具体实施方式】
[0012] 实施例1
[0013] 1、破壁：称取小球藻粉100g，配制为10%的小球藻混悬液，经_20°C低温冷冻，后 室温下解冻。重复冻融过程4次，每次冷冻12h ;
[0014] 2、小球藻蛋白提取：将步骤1中冻融完成小球藻混悬液置于磁力搅拌仪2. 5h、后 低温（-2°C )离心10min,转速控制2000r/min，取上清液；
[0015] 3、生物多肽提取：将步骤2中含有小球藻蛋白上清液配制成lg/L溶液，调节pH为 8. 5,置于泡沫分离器中，调节空气流速为50ml/min、待泡沫产生开始计时20min，后立即停 止通气，收集泡沫、低温（-KTC )真空干燥，即得多肽提取液。
[0016] 实施例2
[0017] 1、破壁：称取小球藻粉50g，配制为8%的小球藻混悬液，经-20°C低温冷冻，后室 温下解冻。重复冻融过程4次，每次冷冻12h ;
[0018] 2、小球藻蛋白提取：将步骤1中冻融完成小球藻混悬液置于磁力搅拌仪2. 5h、后 低温（-2°C )离心10min,转速控制2000r/min，取上清液；
[0019] 3、生物多肽提取：将步骤2中含有小球藻蛋白上清液配制成lg/L溶液，调节pH为 8. 5,置于泡沫分离器中，调节空气流速为50ml/min、待泡沫产生开始计时20min，后立即停 止通气，收集泡沫、低温（-KTC )真空干燥，即得多肽提取液。
[0020] 实施例3
[0021] 1、破壁：称取小球藻粉150g，配制为9%的小球藻混悬液，经_20°C低温冷冻，后室 温下解冻。重复冻融过程4次，每次冷冻12h ;
[0022] 2、小球藻蛋白提取：将步骤1中冻融完成小球藻混悬液置于磁力搅拌仪2. 5h、后 低温（-2°C )离心10min,转速控制2500r/min，取上清液；
[0023] 3、生物多肽提取：将步骤2中含有小球藻蛋白上清液配制成lg/L溶液，调节pH为 8. 5,置于泡沫分离器中，调节空气流速为50ml/min、待泡沫产生开始计时20min，后立即停 止通气，收集泡沫、低温（-KTC )真空干燥，即得多肽提取液。
[0024] 对比例
[0025] -种利用酶解小球藻蛋白制备多肽的工艺，其制备工艺如下：小球藻粉一超声波 破碎一加蛋白酶一灭酶活性一冷却一离心一取上清液-测定多肽提取率
[0026] 试验例
[0027] 分别采用实施例1、2、3及对比例的提取方法测定小球藻生物活性多肽提取率试 验
[0028] 采用福林酚试剂法测定小球藻生物活性多肽提取率
[0029] 1.1标准曲线的绘制
[0030] 取6支试管，分别标号0、1、2、3、4、5按表1所不加入试剂，配制为lmg/ml的标准 牛血清蛋白溶液，立即摇匀后，在室温下放置15min，以0号试管作为空白对照，于650nm处 测定各管吸光度值，并以标准蛋白液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标作图，绘制牛血清蛋 白标准曲线。
[0031 ] 表1标准牛血清蛋白溶液的配制
[0033] 1. 2小球藻生物活性多肽提取率计算
[0034] 取4支试管，分别为实施例1、实施例2、实施例3，对比例，按表2加入试剂，配制为 lmg/ml多肽溶液，加入后立即摇匀后，在室温下放置15min，于650nm处测定各管吸光度值， 照标准曲线即可求出提取液中多肽浓度并计算其提取率。
[0035] 表2小球藻生物活性多肽提取液的配制
[0037] 根据牛血清标准溶液，标准曲线的回归方程为Y = I. 1850X+0. 0012R2= 1. 000
[0038] 根据标准方程可知本发明实施例1、2、3以及对比例采用的提取方法，小球藻小球 藻生物活性多肽提取率分别为16. 525 %、16. 425 %、16. 725 %、14. 113 %。
【主权项】
1. 一种利用小球藻蛋白提取生物活性多肽的方法，其特征在于：提取方法具体步骤如 下： 1) 破壁：配制浓度为10%的小球藻混悬液，经-20°c冷冻，后室温下解冻。重复冻融过 程4次，每次冷冻12h ; 2) 小球藻蛋白提取：将步骤1中冻融完成小球藻混悬液置于磁力搅拌仪2. 5h、后低温 (_2°C )离心10min,转速控制2000_2500r/min，取上清液； 3) 生物多肽提取：将步骤2中含有小球藻蛋白上清液配制200ml浓度为2g/L溶液，调 节pH为8.5,置于泡沫分离器中，调节空气流速为50ml/min、待泡沫产生开始计时20min，后 立即停止通气，收集泡沫、冷冻（-KTC )真空干燥，即得多肽提取液。2. 根据权利要求1所述的一种利用小球藻蛋白提取生物活性多肽的方法，其特征在 于：步骤（3)为采用柠檬酸缓冲液调节pH为8. 5。
【专利摘要】本发明公开了一种利用小球藻蛋白提取生物活性多肽的方法，经过小球藻破壁、小球藻蛋白提取、以及最终获得本发明的产品；具体过程采用了泡沫分离法与传统酶法，与超临界萃取技术相比，设备简单，易操作，而且环保，提取得到的多肽液纯度高，适用于工业化应用经本发明的方法小球藻蛋白生物活性多肽提取率范围为16.525％±0.2％。
【IPC分类】C07K1/14
【公开号】CN105017380
【申请号】CN201510470960
【发明人】都宝君
【申请人】都宝君
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月5日