一种光合菌粉剂的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种微生物制剂，特别涉及一种光合菌冻干粉剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 光合细菌是地球上出现最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成体系的原核 生物，是在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称。光合细菌是一类没有形成芽孢 能力的革兰氏阴性菌，它们以光作为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中 的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物；具有固氮、固碳、脱硫等 作用。其生命力强、容易培养，生长繁殖速度快，在人类生活，尤其是对池塘河流、湖泊等水 体污染净化方面起到重要作用，并在水产养殖环境处理方面得到大规模推广和应用。
[0003] 光合菌传统应用模式主要是菌液形式，这种形式可以保持菌体鲜活进入池塘，并 快速生长繁殖；但缺点是菌体容易衰亡，且保藏、运输费用高。若采用粉剂形式则可克服这 些问题。
[0004] 光合菌粉剂一般采用冷冻干燥法制备。而冷冻干燥中时间、温度等工艺条件，以及 保护剂的选择都是重要的控制因素。尤其是保护剂使用不当，则光合菌细胞损失较大，造成 细胞回收获较低的问题。目前，冻干工艺中经常使用的保护剂有麦芽糊精、脱脂奶粉、甘油、 二甲亚砜、海藻糖等。其中麦芽糊精最常用且廉价，但用在光合菌上菌体损失较大；其它几 种保护剂价格都较高，不利于大规模工业化操作。现有技术中为了解决保护剂各自的缺陷， 常规的思路就是用多种保护剂复配使用，综合不同保护剂的特性和优点。但是到目前为止， 本领域技术人员仍未找到特别理想的保护剂和光合菌粉剂制备工艺。光合菌粉剂的活性含 量比较低，加工效率不高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种经济、高效的光合菌粉剂制备方法。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种光合菌粉剂的制备方法， 步骤包括：
[0007] a、自行培养或购买光合菌菌液备用；
[0008] b、用蔗糖和纯净水配置浓度为22-27%的蔗糖溶液备用；
[0009] c、取光合菌菌液，离心收集得浓缩菌液，并称重；
[0010] d、将浓缩菌液与蔗糖溶液按重量比1:1的比例混合均匀，装入塑料包装袋，然后 在常压下，-16°C~-25°C，冷冻2-4h，然后-65°C~_75°C冷冻10_15h ;再置于真空冷冻干 燥机内进行真空冷冻干燥，干燥时间20-26h，温度-50°C以下，真空度200Pa以上；
[0011] e、粉碎物料即得到光合菌菌粉。
[0012] 优选的，所述的蔗糖溶液浓度为25 %。
[0013] 优选的，所述的步骤d中，真空冷冻干燥之前，常压下，-20°C，冷冻3h，然后-70°C 冷冻12h。
[0014] 优选的，所述的步骤d中，真空冷冻干燥条件为：-50°C，真空度250Pa，冷冻干燥时 间 24h。
[0015] 本发明的工艺操作简单，工艺衔接流畅，便于操作、管理。原料成本、设备成本、管 理成本都非常低。并且所制备的光合菌粉剂活性高、易复活。所制备的粉剂活菌数可达 5. 5X 10ncfu/g ;光合菌粉剂按照1%。接种量进行接种，培养3d后OD6q。可达I. 765,4d达 2. 101，远超过市场光合菌成品质量标准要求。而采用复配保护剂的产品和市售产品的活菌 数和复活性能都远低于本发明所制备的产品，很多市售产品甚至存在没有活菌的问题。因 此，可以说本发明的制备方法是经济、高效率的。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例介绍本发明的优选实施例和技术效果，但本发明的技术方案和构 思不仅限于下述优选实施例。
[0017] 实施例一
[0018] (1)自行培养光合菌菌液，菌种为市售的沼泽红假单胞菌；具体操作方法为：
[0019] 1).培养基配方：NaAc lg/L、NH4Cl lg/L、NaHCO3 2g/L、KH2PO4 0· 5g/L、NaCl Ig/ UMgCl2 0· 2g/L、玉米浆 2g/L。其中，除 NH4Cl 和似!10)3外的原料 121°C，灭菌 IOmin ;NH4C1 和NaHCO3配制成10倍母液，真空抽滤灭菌，再以I :10添加到其余组分中制成无菌全价光 合细菌培养基，并分装到5L三角瓶中；
[0020] 2).向光合菌培养基中按照5%接种量接种光合菌菌种；
[0021] 3).用塑料薄膜密封，置于白炽灯照射下30-37Γ培养2-3d即得到光合菌培养液， 收集光合菌菌液30L待用。
[0022] (2)取光合菌菌液，3500rpm离心10min收集浓缩菌液，并分组称重；同时保留一组 培养液作为光合菌水剂样品；
[0023] (3)配制不同的保护剂溶液：①麦芽糊精30%水溶；②蔗糖25%水溶液；③脱脂 奶粉25%水溶液；④脱脂奶粉20% +麦芽糊精10%水溶液；⑤脱脂奶粉20% +蔗糖10% 水溶液；⑥麦芽糊精20% +蔗糖10 %水溶液；
[0024] (4)菌粉制备：将浓缩菌液与上述6个配方溶液按质量比1:1的比例混合均匀后， 分别装入塑料包装袋；先在常压下，_20°C，冷冻3h，然后-70°C冷冻12h ;然后置于真空冷冻 干燥机内，进行真空冷冻干燥24h，冷冻温度-50°C，真空度250Pa ;
[0025] (5)粉碎物料即得到光合菌菌粉。
[0026] 光合菌粉剂和水剂活菌计数：
[0027] 取Ig粉剂加到100毫升自来水中溶解，取1毫升进行试管稀释，最后取1毫升添 加到下层培养基中，制备双层平板进行计数。计数梯度选择10 6、10 7、10 8,每个梯度两个重 复。培养后完成菌落计数。
[0028] 取留存的光合菌水剂按照平板计数法进行计数，计数梯度选择10 8、10 9、10 '每 个梯度两个重复。培养后完成菌落计数。结果见表1所示：
[0029] 表1活菌计数结果
[0030]
[0031] 可见，本发明的方法制备的光合菌粉剂活菌数较菌液没有明显差别，保持了较高 的活菌数浓度。
[0032] 光合菌菌粉复活实验：
[0033] 将光合菌菌粉按照一定浓度接种到液体培养基中进行培养，观察其生长复活情 况。浓度比例设置为1.5%。、1%。、0. 5%。、0. 2%。，每个梯度两个重复。所用液体培养基组成 为：NaAc lg/L、NH4Cl lg/L、NaHC03 2g/L、KH2P04 0 . 5g/L、NaCl lg/L、MgCl2 0.2g/L、玉米浆 2g/L。各组样品的OD6。。值测定结果见表2所示：
[0034] 表2 OD6。。值测定结果
[0037] 从接种后培养效果来看，六种方法制备的光合菌菌粉在0. 2%。-I. 5%。的接种范围 内都可以生长。其中生长情况最好的是保护剂为25%蔗糖溶液的样品，其最低0. 2%。接种 量时OD平均值都能达到1. 847 ;其次是脱脂奶粉，最差的是麦芽糊精。因此为考虑经济性， 建议今后生产光合菌菌粉采用蔗糖25%，制备好的菌粉接种量定为0. 2%。。但单纯从性能 上说，保护剂为25%蔗糖溶液的样品，1%。接种量时，OD值能快速稳定地达到2以上，具有最 佳的复活性能。并且试验证明该复活性能并不随接种量的增加成正比增加，恰恰是在接种 量1%。时达到最佳效果。
[0038] 实施例二
[0039] (1)利用菌种培养光合菌菌液30升，菌种为市售的深红红螺菌，培养方法同实施 例一；本发明对光合菌菌液配置方法没有依赖性，不同培养方法培养的光合菌菌液制备粉 剂都呈现类似的特性；如果有适合配套条件，也可以直接购买菌液使用；
[0040] (2)取光合菌菌液，3000rpm离心12min收集浓缩菌液，并分组称重；
[0041] (3)配制保护剂溶液：浓度为25 %的蔗糖水溶液备用；
[0042] (4)菌粉制备：将各组浓缩菌液与25%的蔗糖水溶液按质量比1:1的比例混合均 匀后，分别装入塑料包装袋；先在常压下，-20°C，冷冻3h，然后-70°C冷冻12h ;然后置于真 空冷冻干燥机内，进行真空冷冻干燥24h，冷冻温度-65°C，真空度200Pa ;
[0043] (5)粉碎物料即得到光合菌菌粉。
[0044] 取市售样品五组，市售产品来源如下：
[0045]
[0046] 随机取本发明制备的样品三组，标记为样品1、2、3,密封、遮阴、常温保藏3个月； 然后与5组市售样品，按实施例一介绍的方法进行活菌数检测和复活性试验，结果如表3所 示：
[0047] 表3本发明产品与市售产品的对比试验数据表
[0049] 注："无"代表无法检测到活菌。
[0050] 可见，本发明的产品在产品活菌数、复活性能等方面明显优于市售产品的整体状 况。
【主权项】
1. 一种光合菌粉剂的制备方法，步骤包括： a、 取光合菌菌液备用； b、 用蔗糖和纯净水配置浓度为22-27%的蔗糖溶液备用； c、 取光合菌菌液，离心收集得浓缩菌液，并称重； d、 将浓缩菌液与蔗糖溶液按重量比1:1的比例混合均匀，装入塑料包装袋，然后在常 压下，-16°C~_25°C，冷冻2-4h，然后-65°C~-75°C冷冻10_15h ;再置于真空冷冻干燥机 内进行真空冷冻干燥，干燥时间20-26h，温度-50°C以下，真空度200Pa以上； e、 粉碎物料即得到光合菌菌粉。2. 根据权利要求1所述的一种光合菌粉剂的制备方法，其特征在于：所述的蔗糖溶液 浓度为25%。3. 根据权利要求1所述的一种光合菌粉剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤d中， 真空冷冻干燥之前，常压下，_20°C，冷冻3h，然后-70°C冷冻12h。4. 根据权利要求1所述的一种光合菌粉剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤d中， 真空冷冻干燥条件为：-50°C，真空度250Pa，冷冻干燥时间24h。5. 用于上述任意一项权利要求所述制备方法的保护剂，由蔗糖和纯净水配置为浓度 22-27%的蔗糖溶液。6. 权利要求1-4中任意一项制备方法所获得的光合菌粉剂的复活方法，将光合菌菌粉 按照1%。的浓度接到液体培养基中进行培养，所述培养基的组成为：NaAc lg/L、NH4Cl Ig/ UNaHCO3 2g/L、KH2PO4 0.5g/L、NaCl lg/L、MgCl2 0.2g/L、玉米浆 2g/L。
【专利摘要】本发明涉及一种微生物制剂，目的是提供一种经济、高效的光合菌粉剂制备方法。制备方法的步骤包括：a、培养光合菌菌液备用；b、用蔗糖和纯净水配置浓度为22-27％的蔗糖溶液备用；取光合菌菌液，离心收集得浓缩菌液，并称重；c、将浓缩菌液与蔗糖溶液按重量比1:1的比例混合均匀，装入塑料包装袋，在常压下，-16℃～-25℃，冷冻2-4h，然后-65℃～-75℃冷冻10-15h；再真空冷冻干燥，冷冻干燥时间20-26h，温度-50℃以下，真空度200Pa以上；d、粉碎物料即得到光合菌菌粉。本发明的工艺操作简单，工艺间接流畅，便于操作、管理。原料成本、设备成本、管理成本都非常低。并且所制备的光合菌粉剂活性高、易复活。
【IPC分类】C12N1/20
【公开号】CN105018374
【申请号】CN201510396949
【发明人】苏艳秋, 罗国强, 李永凯, 符燕华, 刘梅, 李程
【申请人】通威股份有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月8日