一种伊蚊dna条形码标准基因序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种伊蚊DNA条形码标准基因序列。
【背景技术】
[0002] 西表伊蚊，Aedes(Verrallina)iriomotensis(TanakaandMizusawa，1973)，属双 翅目（Diptera)、蚊科（Culicidae)、伊蚊属（Aedes)、奇阳蚊亚属（Verrallina)。伊蚊是蚊 科中最大一属，近1000种，中国有1〇〇余种。伊蚊会传播很多疾病，对人类的健康带来了危 害，黄热病与登革热就主要通过伊蚊传播。中国伊蚊中研究比较多的是埃及伊蚊和白纹伊 蚊。但目前对西表伊蚊的研究比较少，是否可能携带病毒及传播疾病还知之甚少，有待进一 步研究。
[0003] 对蚊虫的鉴定和识别，是监测和控制蚊媒传染病的基础，也是疾病预防与控制的 重要步骤。目前对蚊虫的鉴定主要依靠经验丰富的分类学家对蚊虫的形态特征，但对近缘 种或形态残缺标本的鉴定十分困难。急需新的方法，以弥补传统形态学方法的缺陷。
[0004] DNA条形码技术（DNA Barcoding)是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分 析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。近几年来，DNA条形码技术已被证明是一个行之 有效的生物鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确， 突破以往对经验的过度依赖，能帮助鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种和高级阶元的演 化关系等。
[0005] 作为DNA条形码的标准目的基因，一方面必须足够保守，便于利用通用引物进 行大范围的扩增；另一方面，要有足够的变异来区分不同的物种。因此，鉴定不同的物 种类群需要选择有效的目的基因。目前，在系统发育研究中广泛应用的标志基因是核糖 体12S和16S基因，但因其存在大量的插入和缺失现象，不宜用作条形码基因。线粒体 基因组中存在的13个蛋白编码基因中仅细胞色素氧化酶亚基I (Cytochrome Oxidase Subunit I，C0 I )、线粒体细胞色素13化7吐）、勵4、勵5这4个基因满足基因插入和缺失现 象较少、长度在900bp左右这两个条件，但ND4、ND5进化太快，不可能设计出通用引物，限制 了它们作为全面DNA鉴定系统的目标基因。因此，人们最终选定CO I基因中的一个片段作 为DNA条形码基因。迄今为止，已有诸多研究证明CO I基因在鸟类、鱼类、鳞翅目昆虫、蚊 类、蚁类和弹尾目等类群的分类鉴定中行之有效。因此，可以采用基于CO I基因的DNA条 形码技术对蚊类进行分子鉴定。该方法与传统的分类方法互为佐证，不仅可解决鉴定中标 本残缺不全等问题，而且有利于实现蚊类的快速鉴定。目前，该方法在蚊类分子鉴定中的应 用仅局限在少数蚊种，Genbank中也仅有少数蚊种的CO I基因序列，但至今尚无西表伊蚊 的相关基因序列。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明公开了一种西表伊蚊DNA条形码标准基 因序列及其检测和鉴定方法。
[0007] -种伊蚊DNA条形码标准基因序列，所述基因为西表伊蚊COI基因，其如序列表 SEQ ID NO. 1 所示：
[0008]
[0009] 本发明的内容还包括所述的伊蚊DNA条形码标准基因序列在检测和鉴定西表伊 蚊中的应用。
[0010] 进一步地，所述应用包括西表伊蚊的分子鉴定方法，包括以下步骤：
[0011] 1)从待测的组织中分离提取DNA ;
[0012] 2)以该DNA为模板，选择相应PCR引物，通过PCR扩增待测组织的CO I基因；
[0013] 3)然后取适量步骤2)扩增产物用琼脂糖电泳分离，经染色后观察，如果能特异性 扩增出，600bp左右的条带，则对其进行测序；
[0014] 4)将测序结果与序列表SEQ ID NO. 1所示的伊蚊DNA条形码标准基因序列相比 较，如二者同源性在98%以上，即可判断所述的待测组织即为西表伊蚊。
[0015] 本发明提供的西表伊蚊DNA条形码标准基因序列有利于实现西表伊蚊的快速鉴 定，缩短鉴定时间。本发明的鉴定方法填补了西表伊蚊分子鉴定领域的空白，相对传统形态 学鉴定更高效便利，减少误差，保证结果具有可靠性。
[0016] 为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
【附图说明】
[0017] 图1为西表伊文COI基因PCR扩增产物电泳图谱。其中，1号-11号：西表伊蚊； M:MarkerDLlOObp;12号：空白对照。
[0018] 图2和图3为待检测组织PCR扩增产物电泳图谱。其中，图2 :1号-6号：待检测组 织，M :Marker DLlOObp ;图 3 :1 号：空白对照，2 号-6 号：待检测组织，M :Marker DLlOObp。
【具体实施方式】
[0019]【实施例1西表伊蚊DNA条形码标准检测基因的确定】
[0020] 1、西表伊蚊标本的采集与保存
[0021] 采集西表伊蚊，采获的标本经冷冻处死后直接保存于75%酒精中。
[0022] 2、试验样品的前处理
[0023] 取出保存于75%酒精中的西表伊蚊标本，用解剖针将头、生殖器部分和翅切下， 便于制片进行种类鉴定。剩余部分移入PCR管中，75 %酒精保存，每管一只，并进行唯一性 编号，用于DNA提取。若需较长时间保存，则应将装有西表伊蚊剩余组织部位的PCR管置 于-20°C冰箱冻存。
[0024] 3、DNA模板制备
[0025] 使用市售商品化基因组DNA提取试剂盒提取蚊虫DNA。
[0026] 4、引物合成
[0027] 本实施例所用的引物如下：
[0028]正向引物：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
[0029]反向引物：GGTCAACAAATCATAAAGATAITGG
[0030] 5、PCR 扩增
[0031] 本实施例的PCR反应体系如下：
[0032]
[0033] 西表伊蚊PCR反应程序：
[0034] %。(：预变性 3min ;35 个循环为 ％。(： 3〇sec、45°C 3〇sec、72°C，lmin ;72。(： 7min ; 4。。保
[0035] 存或进行下一步
[0036] 6、PCR扩增产物检测
[0037] 取5ulPCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35min)。Goldview 染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图1。
[0038] 7、基因序列测定
[0039] 选取3-5个效果较好的PCR扩增产物，送生物公司纯化后测序（测序所用引物与 PCR所用引物相同），所得基因序列经校正拼接后即为目的基因序列，获得所述条形码标准 检测基因为CO I基因，其序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
[0040]【实施例2利用条形码标准检测基因序列鉴定未知蚊虫】
[0041] 1、未知蚊虫标本的采集与保存
[0042] 采集未知蚊虫，采获的标本经冷冻处死后直接保存于75%酒精中。
[0043] 2、试验样品的前处理
[0044] 取出保存于75%酒精中的未知蚊虫标本，用解剖针将头、生殖器部分和翅切下，便 于制片进行种类鉴定。剩余部分移入PCR管中，75%酒精保存，每管一只，并进行唯一性编 号，用于DNA提取。
[0045] 3、DNA模板制备
[0046] 使用市售商品化基因组DNA提取试剂盒提取蚊虫DNA。
[0047] 4、引物合成
[0048] 本实施例所用的引物如下：
[0049]正向引物：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
[0050]反向引物：GGTCAACAAATCATAAAGATAITGG
[0051] 5、PCR 扩增
[0052] 本实施例的PCR反应体系如下：
[0053]
[0054]
[0055]PCR反应程序：
[0056]95。(：预变性 3min ;35 个循环为 95°C 30sec、45°C 30sec、72°C，lmin ;72°C 7min; 4。。保
[0057]存或进行下一步
[0058] 6、PCR扩增产物检测
[0059] 取5ulPCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35min)。Goldview 染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图2, 3,如图所示，待检测组织特异性扩增产物均 为600bp左右。
[0060] 7、基因序列测定
[0061] 选取3-5个效果较好的PCR扩增产物，送生物公司纯化后测序（测序所用引物与 PCR所用引物相同），测试结果与西表伊蚊CO I基因序列（SEQ ID NO. 1)相比较，如果其同 源性大于98%，可以确认该未知蚊虫为西表伊蚊。
[0062] 本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明 的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发 明也意图包含这些改动和变形。
【主权项】
1. 一种伊蚊DNA条形码标准基因序列，其特征在于：所述基因为西表伊蚊CO I基因， 其如序列表SEQ ID NO. 1所示： TTTTCGGAGT TTGATCAGGA ATAGTGGGAA CATCTCTAAG TATATTAATT CGTACAGAAT 60 TAAGTCACCC AGGAATATTC ATTGGAAATG ATCAAATTTA TAATGTAATT GTTACAGCTC 120 ATGCTTTTAT TATAATTTTC TTTATAGTAA TACCTATTAT AATTGGAGGA TTTGGAAATT 180 GATTAGTTCC TTTAATACTA GGAGCCCCAG ATATAGCTTT TCCTCGAATA AATAATATAA 240 GTTTTTGAAT ATTACCTCCT TCATTAACAC TCCTTTTATC TAGTTCAATA GTAGAAAATG 300 GAGCTGGAAC AGGATGAACT GTTTATCCAC CTTTATCTGC TGGAACTGCT CATGCAGGGA 360 GTTCAGTTGA TTTAGCAATT TTTTCTTTAC ATTTAGCTGG AATTTCTTCA ATTTTAGGTG 420 CAGTAAATTT TATTACTACA GTAATTAATA TACGGTCAGC AGGAATTACT CTTGATCGTC 480 TTCCTTTATT CGTGTGATCT GTTGTTATTA CAGCTATTCT TTTACTTCTT TCTCTTCCTG 540 TTTTAGCTGG AGCTATTACT ATATTATTAA CAGATCGAAA TTTAAATACT TCATTTTTTG 600 ATCCTATTGG AGGAGGAGAC CCAATTTTAT ATCAACATTT ATTTTGATTT TTTGGTCACC 660 GG 662〇2. 权利要求1所述的伊蚊DNA条形码标准基因序列在检测和鉴定西表伊蚊中的应用。3. 根据权利要求2所述应用包括西表伊蚊的分子鉴定方法，包括以下步骤： 1) 从待测的组织中分离提取DNA ; 2) 以该DNA为模板，选择相应PCR引物，通过PCR扩增待测组织的CO I基因； 3) 然后取适量步骤2)扩增产物用琼脂糖电泳分离，染色后观察，如果能特异性扩增 出，600bp左右的条带，则对其进行测序； 4) 将测序结果与序列表SEQ ID NO. 1所示的伊蚊DNA条形码标准基因序列相比较，如 二者同源性在98%以上，即可判断所述的待测组织即为西表伊蚊。
【专利摘要】本发明公开了一种伊蚊DNA条形码标准基因序列，其特征在于：所述基因为西表伊蚊CO？Ⅰ基因，其序列如序列表SEQ？ID？NO.1所示。本发明的内容还包括所述的伊蚊DNA条形码标准基因序列在检测和鉴定西表伊蚊中的应用。本发明提供的西表伊蚊DNA条形码标准基因序列有利于实现西表伊蚊的快速鉴定，缩短鉴定时间。本发明的鉴定方法填补了西表伊蚊分子鉴定领域的空白，相对传统形态学鉴定更高效便利，减少误差，保证结果具有可靠性。
【IPC分类】C12N15/53, C12Q1/68
【公开号】CN105039364
【申请号】CN201510503896
【发明人】廉国胜, 柯明剑, 林加燕, 汪海波, 田绿波, 莫秋华, 杨泽, 冯子力, 苏影, 李艳兰
【申请人】珠海国际旅行卫生保健中心
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月14日