乙型肝炎病毒核酸(dna)快速定量检测试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学技术领域，利用实时荧光定量PCR反应原理，采用微量核酸释放剂提取、扩增HBV病毒基核酸(DNA)的试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]实时荧光定量PCR (Real-time PCR)是在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离；实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。Real-time PCR可快速、灵敏的检测病毒RNA和DNA以及细菌DNA ;该方法广泛用于人类传染病的诊断和病原定量，在动物病原体基因的检测，畜禽产品的检验检疫，生物制品的鉴定等领域。
[0003]实时荧光定量PCR技术，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法；荧光扩增曲线可分三个阶段:荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期；在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化；而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的PCR产物量也不能计算出起始DNA拷贝数；只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
【发明内容】
[0004]本发明是采用一种微量核酸释放剂一步法操作完成血清、血浆中HBV-DNA的快速释放，获得的核酸适用于荧光定量PCR等下游检测，具有操作简便、使用安全、成本低廉的优点，适合在临床基因检测中推广应用。
[0005]根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒组分如下:核酸释放剂、促释放剂、酶混合液、HBV-PCR反应液、内标、阴性质控品、阳性质控品、定量参考品A?D ；HBV微量核酸释放剂含有 5 ?500mM 的 KC1、0.5 ?20% Triton X-100、I ?100mg/ml 的蛋白酶 K、I ?20mM的NaOH ;促释放剂含有pH值5?8的DMS0、终浓度0.5?10%的BSA ;酶混合液含有Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-N糖基化酶；HBV_PCR反应液含有HBV保守区域引物探针、内标探针、MgCl2、脱氧核糖核苷酸。
[0006]HBV 上游引物序列:5Λ -AGAGTCTAGACTCGTGGTGGAC-3〃。
[0007]HBV 下游引物序列:5r-GAA AAA GTT RCA TGG TGC TGG TG-3,。
[0008]HBV荧光探针物序列及荧光素标记物:
FAM-S^-ACCAATTTA TGC CTA CAG CCT ART ACA AAG-3'BHQ-1。
[0009]内标上游引物序列:5、AATTGGTCAACATGTGAAAGC-3\
[0010]内标下游引物序列:5、GAATGTGGCCAAGGTTCCGTCATTTGG-3\
[0011]内标荧光探针物序列及荧光素标记物:
CY5—5' -AATCTTCTAATTACTGTATATGGAAG-3' BHQ-2。
[0012]在优选的情况下，微量核酸释放剂配制方法为:在灭菌去离子水中加入KCl终浓度为5?500mM，终浓度0.5?20% Triton X-100、终浓度I?100mg/ml的蛋白酶K、终浓度I?20mM的NaOH ;促释放剂:在灭菌去离子水中加入终浓度10%，pH值5?8的DMS0、终浓度0.5?10%的BSA ;质量或体积百分比以提取试剂体积为计算基准；配制的试剂长期保存需-20 °C冻存。
[0013]具体的，在一个优选的实施方案中，本发明所述方法包括如下步骤:
O取微量核酸释放剂5 μ I加入等体积的血清或血浆样本，用移液器吹打混匀10次；
2)每管加30μ I封闭剂，盖好管盖置于普通PCR仪中反应，具体参数如下:
第一步:95°C,10分钟;第二步:4°C，2分钟；
3)将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，小心打开管盖，每管加入2.5 μ I促释放剂并用移液器反复吹打混匀10次；
4)每管加入35μ I的PCR-mix，瞬时离心，置于荧光定量PCR仪扩增。
[0014]根据本发明的一个优选实施方案，本试剂盒的最低检出限可达30IU/ml。
[0015]本发明的微量核酸释放剂采用蛋白变性剂，能快速破坏HBV病毒颗粒外壳蛋白结构释放HBV DNA,与传统的热裂解方式结合同步进行，更有效的保证样本中核酸裂解效率，微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有封闭样本中对PCR扩增具有干扰作用的蛋白质、药物及溶血等各种因素物质的功能，避免检测过程的假阴性；且微量核酸释放剂中含有抑制核酸酶的组分，对PCR后续实验不会产生影响。
【附图说明】
[0016]图1为定量参考品A?D扩增曲线。
[0017]图2为国家参盘灵敏度参考品LO?L5扩增曲线。
[0018]图3为国家参盘灵敏度参考品L6扩增曲线。
【具体实施方式】
[0019]参照一下实施例可以对本发明作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
[0020]实施例1:用本发明方法对国家参盘灵敏度参考品LO?L6进行提取。
[0021]将试剂盒各组分恢复室温，震荡、瞬时离心；根据待测样本的数量，按比例(HBV-PCR反应液33 μ I/人份+内标I μ I/人份+酶混合液I μ I/人份)取相应量的HBV- PCR反应液、内标及酶混合液，充分混匀成PCR- mix,瞬时离心后备用。
[0022]取国家参盘灵敏度参考品LO?L6备用。
[0023]准备相应数量200 μ I无核酸酶PCR反应管，每管加入5 μ I微量核酸释放剂，加入国家参盘灵敏度参考品LO?L6不同浓度样本各5 μ 1，用移液器反复吹打10次。
[0024]加入30 μ I封闭剂，盖好管盖置于普通PCR仪中裂解，具体参数如下:
第一步:95°C，10分钟；第二步:4°C，2分钟。
[0025]将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，小心打开管盖，每管加入2.5 μ I促释放剂并用移液器反复吹打混匀10次。
[0026]每管加入35 μ I的PCR-mix(33 μ I反应液、I μ I酶混合液、I μ I内标)，瞬时离心，置于荧光定量PCR仪扩增；
第一步:UNG酶反应，500C 2分钟，I个循环；
第二步:预变性，95°C 5分钟，I个循环；
第三步:包括变性、退火、延伸及荧光采集；变性，95°C 15秒，45个循环；
退火、延伸及荧光采集，60°C 45秒，45个循环；
第四步:仪器冷却，25°C 10秒，I个循环。
[0027]结果分析条件设定
反应结束后，根据PCR仪说明书及荧光曲线进行手动或自动调整基线和阈值；手动调整时，基线(Baseline)的起始点(Start)设定在3?8之间，终止点(Stop)设定在12?15之间，阈值线(Threshold)通常设定在1000?5000之间(视具体情况而定)。
[0028]检验结果的解释
1)若靶基因FAM通道没有出现标准扩增曲线，同时内标HEX(VIC)通道出现标准扩增曲线，且16彡Ct彡35之间，判为HBV DNA检测阴性；
2)对于测定值在300?2.5X109IU/ml之间的样本，靶基因FAM通道出现标准扩增曲线，同时内标HEX (VIC)通道出现标准扩增曲线，且16彡Ct彡35之间，则报告相应的测定结果；
3)对于测定值>2.5X109IU/ml的样本，靶基因FAM通道出现标准扩增曲线，同时内标HEX通道出现标准扩增曲线，且16彡Ct彡35之间，报告注明> 2.5X109IU/ml ;若需精确定量，可根据结果将样本稀释至2.5 X 109IU/ml以下再复测，并根据以下公式计算样本浓度，结果注明可报告数值；
4)对于测定值在30?300IU/ml的样本，靶基因FAM通道出现标准扩增曲线，同时内标HEX (VIC)通道出现标准扩增曲线，且16 < Ct < 35，表明病毒载量低，测定值仅供参考；
5)对于测定值<30IU/ml的样本，内标HEX (VIC)通道出现标准扩增曲线，且16 ^ Ct ^ 35之间，则报告HBV-DNA含量低于试剂盒检测下限，应结合其他临床诊断指标进行判断；
6)若内标HEX(VIC)通道Ct值> 35或无扩增曲线出现，则该样本检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复检测。
[0029]结果判断
O从附图1可以看出，定量参考品A~D均有标准扩增曲线；且标准曲线相关系数r彡0.980，内标有标准扩增曲线，且16 < Ct < 35 ;
2)从附图2可以看出国家盘灵敏度参考品L0-L5各提取3次，均有标准扩增曲线，且内标有标准扩增曲线，且16 < Ct < 35 ;
3 )从附图3可以看出最低检出限L6 8次提取扩增均有扩增曲线，且内标有标准扩增曲线，且16 < Ct彡35。
[0030]实施例2:提供本试剂盒的临床应用。
[0031]使用本发明的试剂盒在3家临床试验机构共完成了 520例血清、50例同一人份血浆样本检测，其中阳性414例，阴性106例，与已获批的同类试剂盒参比，参比试剂检测为阳性的样本414例，阴性样本106例；考核试剂对HBV核酸定性检测的阳性符合率为100%，阴性符合率为100%，总符合率为100%，Kappa为I ;本发明提供一种乙型肝炎病毒核酸(DNA)定量检测试剂盒(荧光PCR “一管法”)与对照试剂检测结果一致性较好，为病人的诊断、治疗提供临床辅助证明；如样本中检测HBV病毒的存在，建议立即采取必要措施。
【主权项】
1.一种乙型肝炎病毒核酸(DNA)定量检测试剂盒(荧光PCR"—管法”)，利用针对HBV核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异性荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现乙型肝炎病毒DNA的定量检测，具有操作简便、使用安全、成本低廉的优点。2.该试剂盒含有核酸释放剂、促释放剂、封闭剂、酶混合液、HBV-PCR反应液、内标、阴性质控品、阳性质控品、定量参考品A?D ;核酸释放剂含有KCl、Triton X-100、蛋白酶K、NaOH ;促释放剂含有DMSO、BSA ;酶混合液含有Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-N糖基化酶；HBV-PCR反应液含有HBV保守区域引物探针、内标探针、MgCl2、脱氧核糖核苷酸。3.该技术采用微量核酸释放剂(MNRR)，可在一管中进行HBVDNA核酸提取与扩增，取5 μ I的微量核酸释放剂加入等体积血清或血浆样本，反复吹打混匀10次，置于PCR仪94°C裂解10分钟，然后迅速降至4°C，小心打开管盖加入2.5 μ I促释放剂并混匀，加入35 μ IPCR反应液进行荧光定量检测。4.采用中检所HBV国家参考品中四个浓度梯度的原病毒血清标准品作为荧光定量PCR的标准品A?D，加阴阳性对照与待测样本同步提取、扩增，实现从样本提取到扩增全程监控。
【专利摘要】本发明公开了一种利用微量核酸释放剂提取HBV病毒DNA的试剂盒以及使用方法，属于分子生物学技术领域，利用实时荧光定量PCR反应原理，采用微量核酸释放剂提取、扩增HBV病毒基核酸（DNA）的试剂盒及其使用方法；试剂盒提取方法包括以下步骤：裂解、促释放、扩增；本试剂盒的优点在于采用微量核酸释放剂提取扩增，简便、灵敏、快速、准确，最低检出限为30IU/ml；微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有封闭样本中对PCR扩增具有干扰作用的蛋白质、药物及溶血等各种因素物质的功能，避免检测过程的假阴性；在扩增的过程中加入了内标质控品，能有效的监控样本的提取、扩增效率。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70, C12R1/93
【公开号】CN105063235
【申请号】CN201510452653
【发明人】郭冬冬, 迟磊, 吕翔, 张美娜, 杨海侠
【申请人】宝瑞源生物技术(北京)有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月28日