或结束时出现的具有较低吸光度的部分或多个部分弃去，因为它们包含蛋白聚集体。
[0054] 如本文所用，术语"包含Fc的蛋白的收率"定义为相对于从A蛋白色谱柱洗脱掉的 蛋白的总量，洗脱混合物中收集的蛋白的量。在一些实施方案中，洗脱混合物包含在500mAU 或更高的吸光度值开始并在500mAU或更低的吸光度值结束的部分。
[0055] 如本文所用，术语"峰前"指在指定UV吸光度之前收集且不包括在洗脱混合物中 的蛋白洗脱特征谱的部分。在一些实施方案中，峰前指在吸光度达到500mAU或更高之前回 收的总蛋白。
[0056] 如本文所用，术语"峰后"指在指定UV吸光度之后收集的蛋白洗脱特征谱的部分。 在一些实施方案中，峰后指在吸光度达到500mAU或更低之后回收的总蛋白。
[0057] 在本文中可交换使用的术语"蛋白聚集体"指所关注的产物如包含Fc的蛋白的至 少两个分子的缔合。所关注产物的至少两个分子的缔合可以通过任何方式产生，包括但不 限于非共价相互作用如电荷-电荷、疏水和范德华相互作用；以及共价相互作用如二硫键 相互作用或不可还原的交联。聚集体可以是二聚体、三聚体、四聚体或大于四聚体的多聚体 等。术语"蛋白聚集体"包括包含Fc的蛋白的任何更高级别的物质。
[0058] 可以利用本领域公知并广泛接受的方法大小排阻色谱（SEC)测量蛋白样品中的 聚集体浓度（参见例如，Gabrielsonetal.，J.Pharm.Sci.，96,（2007)，268 - 279)。在一 些实施方案中，利用UV吸光度测量洗脱部分中各种分子量物质的相对浓度，同时通过按照 柱制造商的说明书进行系统校准来确定部分的分子量。测量聚集体浓度的其他方法包括例 如凝胶电泳和光散射。
[0059] 如本文所用，术语"单体"指单一单元的包含Fc的蛋白。例如，在抗体的情况下， 单体由两条重链和两条轻链组成；在独臂抗体的情况下，单体由一条重链和一条轻链组成。
[0060] 如本文所用，术语"配体"指基于A蛋白的C结构域的生物分子，其固定在固体支 持物（例如，多孔表面）上且能够吸引包含Fc的蛋白。在本文所述的一些实施方案中，配 体包含SEQIDN0:3所示的氨基酸序列，或者其变体、片段或衍生物。在本文所述的一些其 他实施方案中，配体包含SEQIDN0:4所示的氨基酸序列，或者其变体、片段或衍生物。
[0061] 术语"固体支持物"一般指连接配体的任何材料（多孔或无孔）。配体连接至固体 支持物可以通过共价键（例如在接枝的情况下）或者通过包被、粘附、吸附和相似机制。用 于本文所述方法和组合物的固体支持物的实例包括但不限于膜、多孔珠、有翼或多孔纤维、 整体柱。合适的膜包括但不限于表面修饰或未修饰的聚偏氟乙烯（PVDF)、聚醚砜（PES)、聚 醚醚砜（PEES)、纤维素、尼龙、聚四氟乙烯（PTFE)、超高分子量聚乙烯（UPE)。合适的多孔珠 包括但不限于二氧化硅、陶瓷、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯 醇、包括琼脂糖和纤维素在内的多糖。合适的有翼或多孔纤维包括但不限于尼龙、纤维素、 PES。合适的整体柱包括但不限于二氧化硅、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、和聚丙烯酸酯、聚 丙烯酰胺、聚乙烯醇。在一些实施方案中，将配体固定在色谱介质如多孔柱上，然后将其填 充入色谱柱备用。
[0062] 术语"装载密度"是每色谱介质体积装载至色谱柱的含有包含Fc的蛋白的样品的 量。装载密度以g/L测量。在一些实施方案中，以5g/L、或10g/L、或12g/L、或15g/L、或 20g/L、或30g/L、或40g/L或更高的装载密度装载样品。
[0063] "缓冲液"是通过其酸-碱缀合组分的作用抗pH变化的溶液。可以例如根据期望 的缓冲液pH米用的各种缓冲液描述于Buffers.AGuideforthePreparationandUse ofBuffersinBiologicalSystems,Gueffroy,D.，Ed.CalbiochemCorporation(1975)〇
[0064] 本文中的"平衡缓冲液"是用来制备用于装载靶蛋白的固体支持物（具有固定的 A蛋白）的缓冲液。
[0065] "洗涤缓冲液"在本文中用来指在装载之后和洗脱靶蛋白之前通过固体支持物（具 有固定的A蛋白）的缓冲液。
[0066]II.A蛋白色谱
[0067]A蛋白色谱是一种亲和色谱形式，最常用于纯化包含Fc的蛋白如免疫球蛋白或抗 体。一般来说，在合适的细胞培养中表达靶蛋白（例如，包含Fc的蛋白），并且使细胞培养 进料进行澄清，然后将澄清的进料装载至A蛋白色谱介质，例如，填充在色谱柱中。
[0068]A蛋白色谱一般采用固体支持物如多孔珠或树脂，具有固定在其上的合适的A蛋 白配体。然后将A蛋白结合的固体支持物填充在色谱柱中。可以首先将柱用合适的平衡缓 冲液平衡。然后通过用含有包含Fc的蛋白的样品（例如，澄清的细胞培养进料）装载柱来 使包含靶蛋白（例如，包含Fc的蛋白）的澄清进料与柱中的固体支持物接触。通常，可溶 性杂质如宿主蛋白和DNA不结合至A蛋白，因此在流过中去除并转移至废物中。随后，通过 暴露于合适的洗脱缓冲液来从A蛋白色谱柱洗脱结合的包含Fc的蛋白。通常洗脱的流速 范围为60个柱体积（CV) /小时至5个CV/小时。在梯度洗脱的情况下，通常洗脱进行5-60 个柱体积。
[0069] 如本文所述，包含Fc的蛋白的洗脱可以利用两种不同方法进行。在一些实施方案 中，将高pH缓冲液和低pH缓冲液混合以产生范围为pH7. 0-3. 0的pH梯度。在一些实施方 案中，pH梯度在7. 0、或约6.8、或约6.6、或约6.4、或约6.2、或约6.0、或约5. 8、或约5. 6、 或约5. 4、或约5. 2、或约5. 0、或约4. 8、或约4. 6、或约4. 4、或约4. 2、或约4. 0开始，并且 pH梯度在3. 0、或约3. 2、或约3. 4、或约3. 6、或约3. 8结束。
[0070] 在固定体积的部分中收集洗脱的蛋白用于单体对聚集体含量的进一步分析。
[0071] 在一些实施方案中，以pH值的降序顺序使用不同pH值的两种或更多种缓冲液以 洗脱A蛋白结合的包含Fc的蛋白。在一些实施方案中，用于分步洗脱的第一缓冲液具有 4. 4、或约4. 2、或约4. 0、或约3. 8、或约3. 6的pH;而用于分步洗脱的第二缓冲液具有3. 5、 或约3. 4、或约3. 3、或约3. 2、或约3. 1、或约3. 0的pH。
[0072] 在一具体实施方案中，第一缓冲液具有约3. 75的pH，而第二缓冲液具有约3. 0的 pH。在固定体积的部分中收集洗脱的蛋白用于单体对聚集体含量的进一步分析。
[0073] 在一些实施方案中，分步洗脱用来洗脱A蛋白结合的包含Fc的蛋白，而pH的小变 化用于随时间的多步洗脱蛋白。随后可以将多个洗脱混合物合并以回收包含Fc的蛋白。
[0074] 在一些实施方案中，分步洗脱采用pH降序的一系列小pH变化步骤，每个pH步骤 与前一pH步骤的差异为约0. 1-约0. 5的pH值。例如，在一些实施方案中，pH的高点为约 5. 0,其以0. 1-0. 5的pH值的分步方式减少，pH的低点为约3. 0。在一具体实施方案中，一 系列小pH变化步骤包括以下列顺序的pH值：5. 0 ;4. 8 ;4. 6 ;4. 4 ;4. 2 ;4. 0 ;3. 8 ;3. 6 ;3. 4 ; 3. 2 和 3. 0〇
[0075] 额外的缓冲液也可以用于所述方法，其促进蛋白结合至A蛋白配体。这类缓冲液 通常具有比用于分步洗脱步骤的缓冲液更高的pH。
[0076] III.用于本文所述方法的示例性缓冲液
[0077] 如上文讨论的，通常在用含有包含Fc的蛋白的样品装载柱之前平衡A蛋白色谱 柱。在一些实施方案中，使用的平衡缓冲液是等渗的，具有6. 0-8. 0的pH。示例性平衡缓冲 液包含 25mMTris、25mMNaCl、5mMEDTA，pH7. 1。
[0078] 在A蛋白色谱期间通常采用的另一缓冲液是装载缓冲液。装载缓冲液用来将包含 Fc的蛋白以及蛋白聚集体的混合物装载至其上固定A蛋白的固体支持物。通常，平衡和装 载缓冲液是相同的。
[0079] 随后用洗脱缓冲液洗脱A蛋白结合的包含Fc的蛋白。在本文所述的一些实施方 案中，洗脱缓冲液包含高PH缓冲液和低pH缓冲液，从而形成pH梯度，这通过调整洗脱缓 冲液中高pH缓冲液和低pH缓冲液的百分比而形成。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有 7. 0-3. 0或6. 0-3. 0的pH。在不存在任何蛋白的情况下测量如本文所用的pH值。可以使 用的PH缓冲液的实例包括但不限于Tris、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、甲酸和铵缓冲液，以 及这些的组合。优选的缓冲液为柠檬酸盐、乙酸盐和甲酸缓冲液。
[0080] 在一些实施方案中，pH梯度的高点的范围为pH5. 1-6.0,而pH梯度的低点的范围 为pH3. 0-3. 7。
[0081] 在分步洗脱以及使用一系列小pH变化步骤的情况下，以递减的pH值的次序顺序 使用两种或更多种缓冲液。这些缓冲液可以如上文所述利用相似的缓冲液预制，或者利用 色谱系统混合以维持它们的pH。
[0082] 不希望被理论束缚，在一些实施方案中考虑pH梯度洗脱方法可以与pH分步洗脱 方法联用，例如，在另一种之后使用一种。
[0083] IV.用于本文所述方法的示例性配体
[0084] 本发明的方法采用基于A蛋白的C结构域的A蛋白配体。在一些实施方案中，用 于本文所述方法的配体包含SEQIDN0:3所示的氨基酸序列。在其他实施方案中，用于本 文所述方法的配体包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。本发明还涵盖这些序列的变体、 片段和衍生物，其结合包含Fe的蛋白，以及如本文所述进行pH梯度或pH分步洗脱方法时， 使得在洗脱包含Fe的蛋白之前洗脱至少30 %的蛋白聚集体。
[0085]V.测量含有包含Fe的蛋白的洗脱混合物中蛋白聚集体水平的方法
[0086] 蛋白可以聚集或错误折叠。当使用亲和色谱如A蛋白色谱时，期望的靶蛋白（即， 单体）常与蛋白聚集体共纯化。因此，蛋白聚集体常常最终在包含靶蛋白的洗脱混合物中， 并且通常使洗脱混合物进行一个或多个随后的步骤以去除这类聚集体。这类额外的步骤可 以包括在它们的电荷、疏水程度或大小的基础上分离聚集体的色谱技术。示例性技术包括 但不限于离子交换色谱、疏水相互作用色谱、混合模式色谱或大小排阻色谱。这些技术通常 在A蛋白步骤之后去除蛋白聚集体。但是，这些方法中的每种均需要额外的缓冲液、树脂或 吸附剂用于进一步纯化，导致较长的加工时间和较高的成本。
[0087] 本文所述的方法使得在A蛋白洗脱步骤期间于靶蛋白之前和之后去除蛋白聚集 体，从而增加总产物纯度并减少通常需要用来去除蛋白聚集体的额外步骤的数量或者避免 需要使用一个或多个额外步骤。
[0088] 如本文证实的，相对于现有技术所述的仅在洗脱靶蛋白之后去除蛋白聚集体的方 法，包含靶蛋白的洗脱混合物中的蛋白聚集体水平显著较低。结果，如通过蛋白单体对总蛋 白的比例测量的，洗脱混合物中靶蛋白的纯度增加。
[0089] 可以利用本领域已知的许多方法和本文所述的方法测量各种洗脱部分中的蛋白 聚集体水平。例如，可以利用动态光散射、高压大小排阻色谱、非对称流场