一种基于超滤浓缩从大体积孕妇尿液中提取绒促性素粗品的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术提取天然药物，具体涉及一种基于超滤浓缩从大体积孕妇尿 液中提取绒促性素粗品的方法。
【背景技术】
[0002] 绒促性素（ChorionicGonadotrophin)又称人绒毛膜促性腺激素（Human ChorionicGonadotrophin)，简称HCG，1927 年由Aschhein和Zondek从孕妇尿中发现，绒 促性素是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，主要存在于怀孕妇女的尿和血液中。
[0003] 绒促性素是由a和0二聚体的糖蛋白组成的一种激素，其a亚基和0亚基通 过非共价疏水和离子的相互作用结合在一起，绒促性素的分子量大约为32KD，其分子量的 25%-41%来自于糖侧链(常规的绒促性素为25%-30%，高糖基化的绒促性素为35%-41%)，a 亚基有92个氨基酸残基，P亚基有145个氨基酸残基。
[0004] 绒促性素是胎盘滋养细胞分泌的一种促性腺激素，在受孕后10-14天开始分泌， 在妊娠最初3个月，HCG水平每2. 2天月升高一倍，以维持妊娠。非孕妇尿液中HCG-般小 于25IU/L，孕40天尿液中HCG含量大于5000IU/L。
[0005] 绒促性素对雌性能促使卵泡成熟及排卵，并使破裂卵泡转变为黄体，促使其分泌 孕激素。对雄性则具有促间质细胞激素的作用，能促进曲细精管功能，特别是睾丸间质细胞 的活动，使其产生雄激素，促使性器官和副性征发育、成熟，促使睾丸下降并促进精子生成。 临床上主要用于促进排卵，治疗不孕不育，以及妊娠早期先兆流产、习惯性流产以及低促性 腺功能减退症，近期研究表明绒促性素可以用来治疗癌症等。
[0006] 绒促性素粗品的传统制备方法为收集孕妇尿液在尿液中直接加入苯甲酸钠，再加 入盐酸反应生成苯甲酸，吸附绒促性素等尿蛋白，再加入酒精使蛋白沉淀，收集HCG沉淀， 干燥。该方法的缺点在于原尿体积太大，苯甲酸钠吸附率低，为保障充分吸附往往加入过量 苯甲酸钠(一般为原尿液量的2-3%左右)，且反应时间长需要搅拌吸附至少2小时，该过程 中HCG容易发生降解；原尿中水分较多，调pH时需要浪费大量盐酸。
[0007] CN103193880A公开的方法，采用超滤浓缩方法将尿液浓缩至原重量4-5%，加入少 量无水氯化钙后直接用丙酮沉淀，对目标蛋白的沉淀效率低，产品收率仅为40%左右；另外 由于尿液中杂蛋白很多，该方法容易将尿液中各种杂质蛋白沉淀下来，得到的产品单位活 性低，不利于后续的HCG纯化操作。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供了一种基于超滤浓缩从大体积尿液中提取绒促性素粗品 的方法。通过超滤浓缩，减少试剂的使用量，同时液体浓缩后进行吸附大大提升吸附效率， 提高产品的活性收率。
[0009] 本发明是这样来实现的，方法步骤为： a. 收集新鲜孕妇尿液，冷却至温度2-8°C后用截留分子量IOkDa超滤膜进行浓缩，浓缩 至原尿液体积的10% ; b. 向a中浓缩液加入6-8%的苯甲酸钠后，搅拌15-30分钟至苯甲酸钠完全溶解； c. 向b溶液中加入盐酸调pH至3. 8-4. 0,温度2-8°C下继续搅拌30-60分钟，析出大 量白色不溶物，溶液变成白色悬浊液；将该悬浊液灌入滤布袋中，过滤收集白色不溶物，甩 干； d. 向不溶物中搅拌加入2-8°C预冷过的食用酒精（v/w95%)直至酒精终浓度为80%，溶 液中析出大量白色絮状沉淀，将该沉淀在2-8°C下静置8-12小时； e. 虹吸去除e中的上清液，真空抽滤收集沉淀，并用丙酮脱水2-3次，减压干燥得到人 尿域促性素粗品。
[0010] 本发明的技术效果是：本发明的方法较传统工艺比具有浓缩后提取效率高；苯甲 酸钠和盐酸用量仅为原用量的三分之一，降低了生产成本；尿液浓缩后水分大大减少，液体 中绒促性素蛋白浓度增加，更利于绒促性素与苯甲钠结合，产品活性收率提高近一倍，高达 80%以上，得到粗品单位活性大于10IU/mg，比活性大于15IU/mg.pr。
[0011]
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 一种基于超滤浓缩从大体积孕妇尿液中提取绒促性素粗品的方法，步 骤如下： 收集1000 kg健康孕妇尿液，冷却至温度2-8°C后用截留分子量IOkDa超滤膜进行浓缩， 浓缩至IOOkg尿浓缩液；向其中加入6kg的苯甲酸钠后，搅拌15分钟至苯甲酸钠完全溶解； 加盐酸调pH至3. 9，温度2-8°C下继续搅拌30分钟，析出大量白色不溶物，溶液变成白色悬 浊液；将该悬浊液灌入滤布袋中，过滤收集白色不溶物，甩干；向不溶物中搅拌加入2-8°C 预冷过的食用酒精（v/w95%)直至酒精终浓度为80%，溶液中析出大量白色絮状沉淀，将该 沉淀在2-8°C下静置9小时；虹吸去除e中的上清液，真空抽滤收集沉淀，并用丙酮脱水2-3 次，减压干燥得到人尿绒促性素粗品882g。
[0013] 实施例2 -种基于超滤浓缩从大体积孕妇尿液中提取绒促性素粗品的方法，步骤如 下： 收集1200kg健康孕妇尿液，冷却至温度2-8°C后用截留分子量IOkDa超滤膜进行浓 缩，浓缩至120kg尿浓缩液；向其中加入8. 4kg的苯甲酸钠后，搅拌15分钟至苯甲酸钠完全 溶解；加盐酸调pH至3. 9,温度2-8°C下继续搅拌45分钟，析出大量白色不溶物，溶液变成 白色悬浊液；将该悬浊液灌入滤布袋中，过滤收集白色不溶物，甩干；向不溶物中搅拌加入 2-8°C预冷过的食用酒精（v/w95%)直至酒精终浓度为80%，溶液中析出大量白色絮状沉淀， 将该沉淀在2-8°C下静置10小时；虹吸去除e中的上清液，真空抽滤收集沉淀，并用丙酮脱 水2-3次，减压干燥得到人尿绒促性素粗品1160g。
[0014] 实施例3 -种基于超滤浓缩从大体积孕妇尿液中提取绒促性素粗品的方法，步骤如 下： 收集1500kg健康孕妇尿液，冷却至温度2-8°C后用截留分子量IOkDa超滤膜进行浓 缩，浓缩至150kg尿浓缩液；向其中加入12kg的苯甲酸钠后，搅拌15分钟至苯甲酸钠完全 溶解；加盐酸调pH至3. 9,温度2-8°C下继续搅拌60分钟，析出大量白色不溶物，溶液变成 白色悬浊液；将该悬浊液灌入滤布袋中，过滤收集白色不溶物，甩干；向不溶物中搅拌加入 2-8°C预冷过的食用酒精（v/w95%)直至酒精终浓度为80%，溶液中析出大量白色絮状沉淀， 将该沉淀在2-8°C下静置12小时；虹吸去除e中的上清液，真空抽滤收集沉淀，并用丙酮脱 水2-3次，减压干燥得到人尿绒促性素粗品1455g。
[0015] 采用以上实施例中的方法制备人尿绒促性素粗品，收率和活性检测结果如下：
【主权项】
1. 一种基于超滤浓缩从大体积孕妇尿液中提取绒促性素粗品的方法，其特征是方法步 骤为： a. 收集新鲜孕妇尿液，冷却至温度2-8°C后用截留分子量IOkDa超滤膜进行浓缩； b. 向a中浓缩液加入苯甲酸钠后，搅拌15-30分钟至苯甲酸钠完全溶解； c. 向b溶液中加入盐酸调pH至3. 8-4. 0,温度2-8°C下继续搅拌30-60分钟，析出大量 不溶物变成白色悬浊液；将上述悬浊液灌入滤布袋中，过滤收集白色不溶物，甩干； d. 向不溶物中搅拌加入2-8°C预冷过的重量体积比为95%食用酒精，直至酒精终浓度 为80%，溶液中析出大量白色絮状沉淀，将该沉淀在2-8°C下静置8-12小时； e. 虹吸去除e中的上清液，真空抽滤收集沉淀，并用丙酮脱水2-3次，减压干燥。2. 如权利要求1所述的人尿绒促性素粗品的制备方法，其特征在于，所述的步骤a中， 超滤膜截留分子量为10kDa。3. 如权利要求1所述的人尿绒促性素粗品的制备方法，其特征在于，所述的步骤a中， 浓缩后的尿浓缩液的体积为原尿体积的10%。4. 如权利要求1所述的人尿绒促性素粗品的制备方法，其特征在于，所述的步骤b中， 向尿浓缩液加入苯甲酸钠的量为尿浓缩液的6-8%。
【专利摘要】一种基于超滤浓缩从大体积孕妇尿液中提取绒促性素粗品的方法，方法步骤为：a.收集新鲜孕妇尿液，超滤浓缩；b.向尿浓缩液加入苯甲酸钠搅拌溶解；c.盐酸酸化，析出大量白色不溶物，过滤收集不溶物甩干；d.向不溶物中搅拌加入预冷的酒精析出大量絮状沉淀，静置；e.虹吸e中的溶液上清液，抽滤收集沉淀，脱水，干燥。采用上述方法生产人尿绒促性素粗品，较传统粗品制备方法，超滤浓缩后进行苯甲酸钠吸附，一方面减少了苯甲酸钠、盐酸和乙醇用量，降低了生产成本；另一方面浓缩后的尿液HCG浓度增加更利于苯甲酸钠对HCG的吸附，提升吸附效率，活性收率提高至80%。
【IPC分类】C07K1/36, C07K14/59, C07K1/34, C07K1/30
【公开号】CN105085660
【申请号】CN201510514368
【发明人】万偲, 魏超娟, 黄朝晖, 张素芳, 徐富勇
【申请人】江西浩然生物医药有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月21日