一种热休克蛋白基因在耐高温大肠杆菌构建中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属基因工程领域，具体涉及一种经过体外定向分子进化的极端嗜热古菌 (Pyrococcushorikoshii)热休克蛋白基因PhHSPS及其应用，特别是涉及所述基因在耐高 温菌株构建中的应用。
【背景技术】
[0002] 热休克蛋白（HeatShockProtein，HSP)是生物受到环境中物理、化学、生物、精神 等刺激时发生应激反映而合成的蛋白质，又名应激蛋白（StressProtein,SP)，是一类高度 保守的蛋白质，普遍存在于原核和真核生物中。最早关于HSP的报道见于1962年，Ritossa 观察到将果蝇幼虫的饲养温度从25 °C提高到°C，30min后，其唾液腺染色体上出现了特殊 的"膨突"。后来研究发现，这种膨突的生成与该区带基因的转录加强有关，提示热休克时 可能有某种蛋白合成的增加。人们将这种现象称为热休克反应或热休克应答（heatshock response,HSR)〇
[0003] 热休克蛋白在热防御中的作用主要指生物或细胞的热耐受能力增强，无论是植物 细胞还是一些低等生物，当预先经受过一次中等程度的热暴露处理后，就能耐受其后的一 个强烈的热处理。换言之，亚致死性热休克可使细胞获得对随后的致死性热处理产生热耐 受，从而大大增强了细胞的生存能力。许多实验直接证明，热耐受的产生与HSP有关，热耐 受的消失与HSP的降解相一致，在热休克蛋白不被诱导的发育阶段，有机体对热极其敏感， 也不能建立热耐受，在一定量的HSP存在时，不需预先进行热休克处理，细胞也可产生热耐 受，不能获得热耐受的变异细胞无HSP的诱导，阻断HSP的产生可阻止热耐受的获得。
[0004] 目前由于传统能源对环境的污染，世界许多地方已经开始用清洁可再生的乙醇当 做重要能源广泛应用。很多微生物可应用于生产乙醇，它们是乙醇发酵生产中十分重要的 微生物细胞工厂，但是传统的微生物发酵温度比较低，（例如酿酒酵母最适的发酵温度为 28~33°C，一般不超过36°C)，这是制约乙醇发酵生产的一个很大的瓶颈，它会大大提高乙醇 生产成本。如果可以选育出耐受高温微生物，则有减少染菌机率、缩短发酵周期、提高发酵 率与减少冷却水使用费用等优点，这将对提高发酵性能和降低生产成本具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 在本发明中，我们改造了一种来源于极端嗜热古菌（Pyrococcushorikoshii)的 热休克蛋白经过体外定向分子进化，获得了突变的热休克蛋白/?*'/?'并且利用基 因工程技术成功的将此基因转入到大肠杆菌中，并且经过一系列测试，发现改造过的突变 基因能够显著的提高大肠杆菌的耐高温胁迫能力，从而为提高微生物的高温耐受性提供一 种解决的方案。
[0006] 因此，本发明所要解决的技术问题之一，在于提供一种比野生型极端嗜热古菌 (Pyrococcushorikoshii)热休克蛋白基因/???/5具有更高耐热能力的经过突变的热休克 蛋白基因/^?75。
[0007] 本发明所要解决的技术问题之二，在于提供所述的来源于极端嗜热古菌 (Pyrococcushorikoshii)的热休克蛋白基因/???/?"在微生物耐高温胁迫中的应用，即将 突变后的/^/575基因转入大肠杆菌内，并对该转基因大肠杆菌进行功能验证，以证明它具 有提1?大肠杆菌耐热性的的功能。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。
[0009] 所述的经过DNA-shuffling的极端嗜热古菌（Pyrococcushorikoshii)的热休克 蛋白基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2 所示。该热休克蛋白基因长519bp，含519个碱基，编码的氨基酸172个。
[0010] 所述的极端嗜热古菌（Pyrococcushorikoshii)的热休克蛋白基因/???/5/,采用 人工方法合成。即依照PTDS(PCR-basedtwo-stepDNAsynthesis,PTDS)方法克隆源自 极端嗜热古菌（Pyrococcushorikoshii)的热休克蛋白基因/???/5,进行化学合成，在保持 /???/5基因的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成本发明的极端嗜热古菌（Pyrococcus horikoshii)的热休克蛋白基因
[0011] 人工合成的进行体外定向分子进化，将所获得的突变的基因转入 大肠杆菌，经过37生长1小时后转入在55°C下过夜生长，第二天选取生长良好菌落抽提DNA，并且测序，最终得到/?*'/?'序列。将获得的/?*'/?'基因转化大肠杆菌，经过耐高温 评价，获得具有基因耐高温大肠杆菌菌株。
[0012] 由此说明：本发明的源于极端嗜热古菌（Pyrococcushorikoshii)的热休克蛋白 基因7^/575经过体外定向分子进化获得了能够提高大肠杆菌高温耐受力的基因，这使得 此基因用于提高微生物高温耐受性成为了可能。
[0013]
【附图说明】
[0014] 图1突变基因办热取与氨基酸序列比对结果。
[0015] 图2经过高温筛选，获得的大肠杆菌阳性单菌。
[0016] 图3高温（53°C)处理后获得突变耐高温菌株与野生型基因生长情况。
[0017]
【具体实施方式】
[0018] 以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案 而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理 解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范 围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
[0019] 本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛一奥德里奇（Sigma-Aldrich)公 司。
[0020] 本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书（J.萨 姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科学出版社)。
[0021] 实施例1极端耐高温基因/???/5/的人工合成 依照PTDS (PCR-based two-step DNA synthesis, PTDS)方法克隆源自极端嗜热古菌 (Pyrococcus horikoshii)的热休克蛋白基因/???/5,进行化学合成，在保持热休克蛋白基 因/???/5的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成本发明的热休克蛋白基因设 计的引物如下：
TTA, TTC, GAT, CTT, GAC, CTC, GAA, TCC, CTC, TCC, TTC, CTT, CTT, TGT, TG利用PCR进行/5MSd基因扩增，在IOOW反应体系中，/^?^/-2至/5MSF/-9共8个引 物的添加量为2ng，外侧引物/???/5/ -1和/???/5/ -10添加量为30ng，扩增条件为：94°C 预热Imin;94°C30s，50°C30s，72°C2min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶 (Toyobo公司，日本)，共25个循环。
[0022] PCR结束后，1%琼脂糖胶回收，取10 W直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公 司）。4°C连接过夜，高效转化DH5 a感受态中，获得阳性克隆经过上海桑尼公司测序分析， 所得序列即为本发明的热休克蛋白基因(/^?7Y)，该热休克蛋白基因长519bp，含519个碱 基，编码的氨基酸172个。
[0023] 实施例2合成/???/5/基因DNA-shuffling突变 1)通过多位点定点突变的方法，消除基因中的及mz/OT和SacI等限制性内切酶 位点。
[0024] 2)按照/5MSF/测定序列设计两端引物，在基因两端SaMlI和SacI增加酶切位点， 以基因为模板进行PCR扩增，试剂盒回收扩增片断。
[0025] 3)用DNaseI降解的产物经12%聚丙烯酰胺电泳分离，透析袋法回收IOObp以下小 片段。
[0026] 4)以回收的小片段为模板进行无引物PCR(PrimerlessPCR)，50个循环后，扩增 产物经I. 0%Agrose电泳检测。
[0027] 5)根据PrimelessPCR电泳的结果，取PrimelessPCR扩增后的产物，加入引 物后，进行常规引物PCR反应，PCR扩增产物经1.0%Agrose电泳，透吸袋法回收经DNA ShuffIing突变的 /???/5/ 基因。
[0028] 6)用来自Crab的DSN酶对突变基因进行均一化处理，均一化后将大幅度 增加突变基因的种类和比例。
[0029] 7)将突变的/???/5/与载体连接，构建突变基因的原核表达文库。
[0030] 实施例3突变基因的体外定向分子进化 1)制备大肠杆菌大肠杆菌EG50化学感受态，方法参照分子克隆实验指南（Raineriet al. , 1990)〇
[0031] 2)取50^大肠杆菌6650感受态细胞，加入1^突变0嫩，充分混匀，201^11后将 混合物涂在含有氨苄青霉素的2YT平板，先恢复培养1小时（37°C)，然后将平板置于55°C 培养箱中生长12h. 3)从步骤2中2YT板上生长的菌中挑取耐高温克隆，酶切鉴定正确后，送上海sunny公 司测序。
[0032] 4)通过测序，将耐高温突变基因与原始合成基因进行序列比对，得到耐高温相关 突变位点的基因
[0033] 实施例4耐高温大肠杆菌构建以及耐高温性验证 1) 制备大肠杆菌大肠杆菌EG50化学感受态，方法参照分子克隆实验指南（著J.莎姆 布鲁克黄培堂译） 2) 将野生型基因作为对照与突变基因进行耐高温比对，具体方法为：取50PLGV3101 感受态细胞，加入IUL突变DNA或者合成的野生型DNA，充分混匀，20min后将混合物涂在 含有氨苄青霉素的2YT平板，培养12小时（37°C)，然后挑取单菌落置于2ml液体LB培养基 中培养12小时，测定OD值，并调整突变基因OD值到与野生型相近。
[0034] 3)吸取I iiL菌液点到含有氨苄青霉素的2YT平板上，37°C培养箱中培养1小时后 转入53°C培养箱中培养12h，通过菌斑的生长状况评价耐高温性能，从而获得耐高温大肠 杆菌以及相应的突变基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸序 列如SEQIDNO2所示。
【主权项】
1. 一种经过体外定向分子进化的来源于极端嗜热古菌（Pyrococcus horikoshii)的 热休克蛋白突变基因PhHSPS，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。2. 根据权利要求1所述的突变热休克蛋白基因PhHSPS，其特征在于，其氨基酸序列如 SEQ ID NO 2 所示。3. 权利要求1或2所述的突变热休克蛋白基因PhHSPS经过转化大肠杆菌，可用于构建 耐高温大肠杆菌菌株。
【专利摘要】本发明公开了一种具有更高耐热性能的极端嗜热古菌(Pyrococcus？horikoshii)的热休克蛋白基因PhHSPS。所述经过突变的耐高温基因PhHSPS，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ？ID？NO2所示。将分子进化获得的突变热休克蛋白基因转化大肠杆菌，发现该突变热休克蛋白基因能显著的提高大肠杆菌的耐热能力，因此该基因能够应用于细菌耐高温菌株的构建。
【IPC分类】C12R1/01, C07K14/195, C12N15/31, C12N15/70, C12R1/19, C12N1/21
【公开号】CN105087602
【申请号】CN201410211217
【发明人】高建杰, 姚泉洪, 彭日荷
【申请人】上海市农业科学院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月19日