一种玉米品种先玉335纯度检测的ssr分子标记试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种分子标记检测试剂盒，特别是涉及一种玉米品种先玉335纯度检 测的SSR分子标记试剂盒。
【背景技术】
[0002] 玉米是我国的重要作物，在农业生产中占有重要地位。玉米种子质量直接影响产 量，玉米种子纯度是评价种子质量的重要指标。实践中，我国玉米种子纯度鉴定仍以籽粒形 态鉴定、幼苗鉴定和田间小区种植鉴定为主体，辅以同工酶和蛋白质电泳技术。
[0003] 利用种子、幼苗或者株型等形态差异鉴定纯度的方法费时费力、受环境和基因显 隐性等的影响较大，检测结果易出现偏差。同工酶和蛋白质电泳技术具有简单、快速、成本 低等优点，然而，而且随着玉米品种的数量逐年增多，种质资源狭窄，同质化问题愈显突出， 难以找到杂交种特征带，难以进行有效的品种纯度检测。
[0004] 利用SSR分子标记技术对玉米品种纯度鉴定的优越性在于：（I)SSR分子标记数量 大，特异性高，可鉴定表型难于鉴别的品种；（2)SSR分子标记不受任何环境因素的影响，可 在生长发育的任何阶段取材鉴定；（3)SSR分子标记呈共显性遗传，操作灵活、简便、快速， 易于分析；（4)利用SSR分子标记鉴定品种，不仅准确可靠，而且还便于实现标准化。
[0005] 玉米品种先玉335是铁岭先锋种子研究有限公司于2005年辽宁省审定的品种，辽 审玉[2005] 250号，以PH6WC为母本，以PH4CV为父本组配而成的。幼苗叶色嫩绿，叶鞘紫 色。株型半紧凑，根系发达，株高306厘米，雄穗分枝3-5个，花丝浅紫色，花药紫色。穗轴 红色，籽粒黄色。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种玉米品种先玉335纯度检测的SSR分子标记试剂盒， 用以检测玉米品种先玉335的纯度，本试剂盒具有快速、准确、简便等优点，可以及时准确 的检测出纯度结果，能够减少假劣种子坑农害农案件的发生，保证粮食种植安全。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 一种玉米品种先玉335纯度检测的SSR分子标记试剂盒，以玉米品种先玉335及父母 本双亲的基因组DNA为模板，通过对覆盖全基因组200对SSR引物进行筛选，获得两对双亲 互补特异性高、重复性好、结果稳定的SSR引物，SEQIDNO:1和2和SEQIDNO:3和4。
[0008]SEQIDNO:1 序列（5, - 3'）CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG SEQIDNO:2 序列（5, - 3'）CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTG SEQIDNO:3 序列（5, 一 3'）GGATGATGGCGAGGATGATGTC SEQIDNO:4 序列（5, 一 3'）CCACCAACCCATACCCATACCAG 所述的一种玉米品种先玉335纯度检测SSR分子标记试剂盒，以玉米品种先玉335的 基因组DNA为模板，以SEQIDNO:1和2或SEQIDNO:3和4为SSR特异性引物，进行PCR 扩增。
[0009] 所述的一种玉米品种先玉335纯度检测SSR分子标记试剂盒，PCR反应体系总体积 201^，包括14.11^超纯水、21^10倍卩〇?缓冲液、1.21^(1犯1^(2.5臟〇1/1)、0.51^ 35尺引物（0.254111〇1/1)、0.21^7 1叫0嫩聚合酶（2.51]/1^)、21^0嫩，混匀。
[0010] 所述的一种玉米品种先玉335纯度检测SSR分子标记试剂盒，反应程序为94°C预 变性5!^11;94°(：变性4〇8,60°(：退火358,72°(：延伸458，循环35次 ；72°(：延伸5111111;4°(：保 存。
[0011] 所述的一种玉米品种先玉335纯度检测的SSR分子标记试剂盒，纯度结果通过带 型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示。
[0012] 试剂盒中还可包括抽提样品DNA所需的各种试剂。这些试剂是本领域技术人员周 知的。
[0013] 本发明的优点与效果是： 本发明在对覆盖玉米全基因组的200对SSR引物进行筛选，获得两对双亲互补特异性 高、重复性好、结果稳定的SSR引物，由其两对特异性引物和7?濟每等试剂开发出针对玉米 品种先玉335纯度检测的试剂盒，可以快速、准确、简便的检测出玉米品种先玉335的纯度， 为品种管理和市场监管提供技术支撑，还对保证粮食种植安全具有一定的指导意义。
[0014] 本发明的试剂盒具有快速、准确、简便等优点，可以及时准确的检测出纯度结果， 能够减少假劣种子坑农害农案件的发生，保证粮食种植安全。
[0015] 本发明的试剂盒可为品种管理和市场监管提供技术支撑。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明的SEQIDNO:1和2扩增玉米品种先玉335及父母本结果图； 图2为本发明的SEQIDNO:3和4扩增玉米品种先玉335及父母本结果图。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。
[0018] 本发明的检测方法为： (1)玉米品种先玉335基因组DNA提取随机数取100粒种子，采取CTAB法进行DAN提 取。
[0019] (2)PCR扩增以SEQIDNO:1和2或SEQIDNO:3和4为SSR特异性引物，配制 20ulPCR反应体系。
[0020] (3)PCR反应体系总体积20yL，包括14.IyL超纯水、2yL10倍PCR缓冲液、 1.21^(1犯138(2.5臟〇1/1)、0.51^551?特异性引物（0.254111〇1/1)、0.21^7 1叫0嫩聚合 酶（2. 5U/yL)、2yLDNA，混匀。
[0021] (4)反应程序为94°C预变性5min;94°C变性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循 环35次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0022] (5)电泳检测对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
[0023] (6)纯度结果通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子 粒数的百分率表示。
[0024] 实施例I 本实施例中用玉米品种先玉335纯度检测SSR分子标记试剂盒，检测玉米品种先玉335 样品A的纯度。操作流程如下： 1)随机数取玉米品种先玉335样品AlOO粒种子，采取CTAB法进行DAN提取。
[0025] (2)PCR扩增以SEQIDNO:1和2为SSR特异性引物，配制20ulPCR反应体系。
[0026] (3)PCR反应体系总体积20yL，包括14.IyL超纯水、2yL10倍PCR缓冲液、 1.21^(1犯138(2.5臟〇1/1)、0.51^551?特异性引物（0.254111〇1/1)、0.21^7 1叫0嫩聚合 酶（2. 5U/yL)、2yLDNA，混匀。
[0027] (4)反应程序为94°C预变性5min;94°C变性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循 环35次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0028] (5)电泳检测对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
[0029] (6)纯度结果通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子 粒数的百分率表示。
[0030] 具有本品种特异带型的种子粒数为99,按公式：
玉米品种先玉335样品A纯度为=99/100=99%。
[0031] 实施例2 本实施例中用玉米品种先玉335纯度检测SSR分子标记试剂盒，检测玉米品种先玉335 样品B的纯度。操作流程如下： 1)随机数取玉米品种先玉335样品BlOO粒种子，采取CTAB法进行DAN提取。
[0032] (2)PCR扩增以SEQIDNO:3和4为SSR特异性引物，配制20ulPCR反应体系。
[0033] (3)PCR反应体系总体积20yL，包括14.IyL超纯水、2yL10倍PCR缓冲液、 1.21^(1贈8(2.5臟〇1/1)、0.5卩1^51?特异性引物（0.25卩111〇1/1)、0.2卩1^&9 0熟聚合 酶（2. 5U/yL)、2yLDNA，混匀。
[0034] (4)反应程序为94°C预变性5min;94°C变性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循 环35次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0035] (5)电泳检测对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
[0036] (6)纯度结果通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子 粒数的百分率表示。
[0037] 具有本品种特异带型的种子粒数为93,按公式：
【主权项】
1. 一种玉米品种先玉335纯度检测的SSR分子标记试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 含有2对双亲互补特异性高、重复性好、结果稳定的SSR引物：SEQ ID NO :1和2和SEQ ID NO :3 和 4 ; SEQ ID NO :1 序列（5, - 3'）CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG ; SEQ ID NO :2 序列（5, - 3'）CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTG ; SEQ ID NO :3 序列（5, 一 3'）GGATGATGGCGAGGATGATGTC ; SEQ ID NO :4 序列（5, - 3'）CCACCAACCCATACCCATACCAG。2. 根据权利要求1所述的一种玉米品种先玉335纯度检测的SSR分子标记试剂盒，其 特征在于，以玉米品种先玉335的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO :1和2或SEQ ID NO :3 和4为SSR特异性引物，进行PCR扩增。3. 根据权利要求1所述的一种玉米品种先玉335纯度检测的SSR分子标记试剂盒，其 特征在于，PCR反应体系总体积20 y L，包括14. I y L超纯水、2 y L 10倍PCR缓冲液、I. 2 y L (1犯138(2.5臟〇1/1)、0.51^551?引物（0.254111〇1/1)、0.21^7 1(3冰嫩聚合酶（2.51]/1^)、 2yL DNA，混匀。4. 根据权利要求1所述的一种玉米品种先玉335纯度检测的SSR分子标记试剂盒，其 特征在于，反应程序为94°C预变性5min ;94°C变性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循环 35 次；72°C 延伸 5min ;4°C 保存。5. 根据权利要求1所述的一种玉米品种先玉335纯度检测的SSR分子标记试剂盒，其 特征在于，纯度结果通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒 数的百分率表示。
【专利摘要】一种玉米品种先玉335纯度检测的SSR分子标记试剂盒，涉及一种分子标记检测试剂盒，本发明利用父母本双亲互补特异性SSR引物对玉米品种先玉335进行纯度检测的方法。该方法以玉米品种先玉335及父母本双亲的基因组DNA为模板，通过对覆盖全基因组200对SSR引物进行筛选，获得两对双亲互补特异性高、重复性好、结果稳定的SSR引物，由其两对特异性引物和<i>Taq</i>酶等试剂开发出针对玉米品种先玉335纯度检测的试剂盒。该试剂盒的开发，不仅可以快速评价玉米纯度质量，为品种管理和市场监管提供技术支撑，还对提高种子产业整体质量水平，保证粮食种植安全具有一定的指导意义。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105087782
【申请号】CN201510449469
【发明人】岳静, 朱志成, 杨双
【申请人】沈阳化工大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年7月28日