用于检测水稻条纹病毒NS2基因的qPCR引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及用于检测水稻条纹病毒ASS基因表达量的 qPCR引物。
【背景技术】
[0002] 水稻在中国的分布十分辽阔，是我国重要的粮食作物，然而，水稻病毒病却严重影 响着中国水稻的产量和质量。水稻条纹叶枯病（Ricestripevirusdisease)是水稻病毒 病之一，该病害会造成水稻减产甚至颗粒无收，被称为水稻上的"癌症"。
[0003] 水稻条纹病毒（ViceKirys，RSV)是水稻条纹叶枯病的病原物，它是纤 细病毒属的代表成员，由4条单链RNA组成，共编码7个蛋白，NS2是其中 的一个蛋白，但目前对该蛋白的研究较少。2011年，NS2被本课题组鉴定为弱沉默抑制子， 并与水稻编码的基因沉默抑制子3(supperssorofgenesilengcing3，SGS3)互作； 2014年，本课题组又发现NS2能与水稻、烟草的纤维蛋白（Fibrillarin，Fib)互作，该互 作关系影响了RSV的积累及运动。可见，NS2在RSV致病过程中起着重要的作用，对其进行 深入研究，有利于完善对ASS基因功能及RSV致病机制的理解。
[0004] 在研究基因功能时，往往涉及基因表达量的检测。半定量RT-PCR法是检测靶基因 表达量的传统方法之一，但该法只是对基因的一个非常粗略的定量，误差较大；荧光实时定 量PCR(qPCR)法是近几十年来新兴的检测靶基因表达量的方法，该法是在PCR反应体系中 加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知 模板进行定量分析的方法，误差较小。在使用qPCR法时，设计合理的qPCR引物甚至、为关 键，该发明所设计的引物尤为适合检测水稻条纹病毒ASSfE基因的表达量。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种用于检测水稻条纹病毒ASS基因表达量的qPCR引物。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 用于检测沉默植株中靶基因的表达量的qPCR引物，所述引物序列为NS2_qPCRF:ATCAACAGACGGAGCATC；NS2-qPCRR：CATTGGTTACAACTATGTGCTT〇
[0007] 所述qPCR反应体系20. 0yL，包括上下游引物10yM各0? 4yL，SYBRqPCRMix 10yL，DEPCH2O8.4yL，cDNA0.8yL;所述qPCR反应条件为：95 °C，Imin;95 °C，15sec; 60 °C，45sec，共 40 个循环。
[0008] 本发明的优点在于： 1.引物优点：GC含量为36%-50%，扩增片段大小为107bp，在优化的体系中，引物用量 合理，上述优点保证了该引物扩增片段的特异性。
[0009] 2.扩增产物的溶解曲线起峰单一，为单峰图，说明不含有非特异性扩增成分，说明 产物为特异性产物，引物特异性好 3.琼脂糖电泳图表明扩增产物非常单一，无引物二聚体，说明引物特异性良好。
[0010] 4.标准曲线显示相关系数R2为0. 995,符合R2X). 98的要求；扩增效率为0. 99,介 于0. 90~1. 05之间，符合作为qPCR引物的要求。
[0011] 上述表明该引物GC含量合理，特异性强，无引物二聚体，其对应的标准曲线符合 qPCR引物要求，非常适合用于检测引物对应的靶基因表达量的检测。
【附图说明】
[0012] 图IqPCR引物扩增的基因片段M:DNA标准分子量；1 :水稻条纹病毒（RSV) ;2 : 水稻草状矮缩病毒（RGSV) ;3:水稻锯齿叶矮缩病毒（RRSV) ; 4:阴性对照（灭菌水为模 板）。
[0013] 图2qPCR扩增产物溶解曲线，扩增产物为么横坐标：相对荧光值；纵坐标：温 度。
[0014] 图3qPCR扩增曲线图（A:模板为RGSVcDNA;B:模板为RRSVcDNA)横坐标：循 环数；纵坐标：荧光值。
[0015] 图4感RSV水稻病株中ASS基因表达量纵坐标：相对表达量；横坐标：感染 RSV水稻植株编号。
【具体实施方式】
[0016] 以下通过具体实施例对本发明作进一步说明 一、水稻病毒总RNA的提取及cDNA的转录 取感染水稻条纹病毒的水稻病叶〇.Ig，迅速放入液氮中，按北京全式金生物技术有限 公司的RNA提取试剂盒（EasyPurePlantRNAKit)说明书提取RNA，具体操作如下： (1) 将研磨好的叶片组织，放入1.5mLEppendorf管中，加入ImL结合缓冲液 (BindingBuffer6，BB6)和10yL(6-巯基乙醇，震荡涡旋数秒，室温放置3min; (2) 12 000rpm离心5min，吸上清至新离心管； (3) 加入1/2倍体积无水乙醇，混匀并涡旋数秒； (4) 将上述混合液移入离心柱中，12 000rpm离心30sec，倒弃流出液，柱子放回离心 管； (5) 加入500yL清洗缓冲液（CleanBuffer6，CB6)到柱子中央，12 000rpm离心 30sec，倒弃流出液； (6) 加入80yLDNaseI工作液到柱子中央，室温放置5min，DNaseI工作配制：70ULReactionBuffer+30UDNaseI； (7) 重复步骤（5); (8) 加500yL洗涤缓冲液（WashBuffer6，WB6)(已加入无水乙醇），12 000rpm离心30sec，倒弃流出液； (9) 重复步骤（8); (10) 12 000rpm离心2min，彻底去除残留的乙醇，室温放置5min; (11) 柱子移至1.5mL新离心管上，并加入50yLRNase-freeH2O至柱子中央，室温 3min，12 000rpm离心 2min; (12) 吸取流出液，再次加入到柱子中央，室温3min，12 000rpm离心2min。
[0017]cDNA第一链合成按北京天根生化科技有限公司的反转录试剂盒（FastQuantRT KitwithgDNase)说明书操作，反应体系及步骤如下： (1)去除基因组DNA(gDNA)的反应体系：
上述混合液瞬离后，42 °C孵育3min，然后至于冰上； (2) 反转录反应体系：
⑶将⑴和⑵两者混匀后，42°C孵育15min; (4)95 °C孵育 3min。
[0018] 二、靶基因溶解曲线的建立 以上述cDNA为模板，按以下体系和程序进行反应，3个重复， PCR反应体系：
PCR反应条件：
三、靶基因标准曲线的建立 将水稻条纹病毒的cDNA按5的倍数进行稀释，共设5个浓度，分别以稀释好的cDNA为 模板，进行荧光定量PCR，每个浓度做3个重复，PCR反应体系：
实例1引物特异性检测 分别病毒即水稻条纹病毒（沿ceWrijOeRSV),水稻草状矮缩病（TPice Ki/m1，RGSV),水稻据齿叶病毒（TPiceKizmi,RRSV) 的cDNA为模板，所述引物序列为NS2-qPCRF:ATCAACAGACGGAGCATC;NS2-qPCRR:CATTGGTTACAACTATGTGCTT。按以下PCR体系和程序进行： PCR反应体系：
结果判断：反应结束后根据琼脂糖电泳图来判断引物的特异性，电泳图显示只有RSV的cDNA可以扩增出条带，且条带单一无引物二聚体，而RGSV和RRSV的cDNA均无法扩增得 至條带（图1)，这表明该引物可特异检测RSV的基因 [0019]实例 2 分别以病毒即水稻条纹病毒（ViceWrijOeRSV),水稻草状矮缩病（TPice Ki/m1，RGSV),水稻据齿叶病毒（TPiceKizmi,RRSV)的 cDNA为模板，按以下体系和程序进行（每个样品3个重复）： PCR反应体系：
结果判断：反应结束后根据扩增曲线图来判断结果，RSV样品在Ct值为20-25开始起 峰且峰值高（图2);而其他样品则在Ct值高于35时才起峰，且峰值低。因此，若该引物能 在Ct值为30之前起峰（图3)，则可判断为RSV的基因么反之，则不可判断。
[0020]实例 3 以感染RSV的水稻cDNA为模板，以水稻延伸因子(GenBank登陆号：GQ848058) 为内参基因，按以下体系和程序进行（每个样品3个重复）：
PCR反应条件：
结果判断：反应结束后，根据各样品的起峰值和qPCR计算公式可获得各样品中勺 表达量分析图，该图为柱型图，柱状高低表示感染RSV水稻样品中靶基因ASSI的相对表达 量，可通过图型来判断表达量的高低（图4)，这表明该引物可作为检测RSVASS的基 因相对表达量的qPCR引物。
【主权项】
1. 用于检测水稻条纹病毒ASSf巴基因表达量的qPCR引物，其特征在于：所述引物序列 为 NS2-qPCRF: ATCAACAGACGGAGCATC; NS2-qPCRR: CATTGGTTACAACTATGTGCTT。2. 如权利要求1所述引物用于检测水稻条纹病毒ASS基因表达量的qPCR方法，其特征 在于：所述qPCR反应体系20.0 yL，包括上下游引物10 yM各0.4 yL，SYBRqPCRMixlO yL，DEPC H2O 8.4 yL，cDNA 0.8 yL;所述 qPCR 反应条件为：95 °C，I min ; 95 °C， 15 sec; 6CTC，45 sec，共 40 个循环。
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测水稻条纹病毒<i>NS2</i>基因表达量的qPCR引物及其检测方法，所述引物序列为NS2-qPCRF：ATCAACAGACGGAGCATC；？NS2-qPCRR：CATTGGTTACAACTATGTGCTT，该引物对GC含量为36%-50%，扩增片段大小为107bp，特异性强，无引物二聚体，其对应的标准曲线符合qPCR引物要求，非常适合用于检测引物对应的靶基因表达量的检测。
【IPC分类】C12Q1/70, C12N15/11, C12Q1/68, C12R1/93
【公开号】CN105087830
【申请号】CN201510529152
【发明人】郑璐平, 林辰, 贺杰, 吴康成, 吴祖建
【申请人】福建农林大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月26日