用于敲除人BTF基因的gRNA序列及其敲除方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明涉及在细胞水平稳定敲除BTF (Bcl-2-associatedtranscriptionfactor1)基因。
【背景技术】
[0002] BTF是KAS0F等利用酵母双杂交系统寻找病毒抗凋亡蛋白E1B19K相互作用蛋白 时新发现的，位于染色体6q21_23区段，该区段稳定性较差，在多种肿瘤中易发生染色体的 缺失。BTF在多种上皮组织均存在较强的表达，如骨骼肌、胎盘、心、脑、肺、肾及胰腺；在肿 瘤细胞HeLaS3、白血病细胞HL-60、K-562、M0L74、结肠腺癌SW480、肺癌细胞A549及巴金 氏淋巴瘤细胞Raji均表达。
[0003]BTF具有basiczipper-like(位于 110 _126aa)、Myb-like(位于 522 _531aa) DNA结合结构域，在正常非凋亡细胞，BTF位于细胞浆，而在凋亡细胞或死细胞BTF位于细胞 核可能发挥其转录因子的功能，激活凋亡相关基因表达。研究表明ElB19K、Bcl-2及Bcl-xL 与BTF存在相互作用，它们可以抑制BTF转运入细胞核，而停留在细胞浆，消除其转录活性。 在DNA损伤反应中，PKCS磷酸化BTF，PKCS/BTF结合于CEP元件，激活下游靶基因P53的 表达，从而发动细胞凋亡及细胞生长阻滞。在依托泊苷诱导的DNA损伤反应中，转录因子 Bcl-2-associatedtranscriptionfactor1(BTForBCLAF1)激活下游革巴基因P53 的表 达，从而发动细胞凋亡及细胞生长阻滞。YYLee等研究表明高剂量放射（10Gy)可以促进 BTF与yH2AX共聚集，抑制DNA双链断裂（double-strandedbreaks,DSBs)s的损伤修复， 增强CEP-P53表达，促进细胞凋亡。BTF-/-敲除小鼠的研究表明BTF在肺发育及免疫系统 稳态中发挥调节细胞凋亡的作用。在肺囊形发育阶段，BTF表达非常强，是平滑肌时间、空 间正确排列所必须的，但在肺发育晚期BTF不表达。
[0004] CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats, CRISPR)是一系列成簇排列的DNA序列，被称作"规律间隔成簇短回文重复序列"，是细菌中 一种对付诸如病毒等外来DNA的防御系统。Cas基因编码的蛋白包含核酸酶、聚合酶、解旋 酶以及与核糖核酸结合的结构域。CRISPR转录出的RNA与Cas蛋白结合形成核糖核蛋白 复合物协同行使CRISPR/Cas系统的免疫功能，来对Cas蛋白起到导向作用，因此这段RNA 也被称为单链导向RNA(singleguideRNA，gRNA)或者是导向RNA(guideRNA)。当复合体 检测到入侵的DNA和gRNA序列一致时，Cas蛋白就能够切割入侵的DNA，达到防御的目的。 只需针对需要编辑的DNA序列合成一段导向RNA的DNA序列，在转入宿主细胞后，产生的人 工构建的gRNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA序列，从而起到基因编辑的作 用。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一方面是提供一种用于CRISPR/Cas9敲除人细胞BTF (Bcl-2-associatedtranscriptionfactor1)基因的gRNA的革E1DNA序列，所述序列如SEQ IDNO: 1 所示。
[0006] 本发明的第二方面是提供一种采用上述DNA序列敲除人细胞BTF (Bcl-2-associatedtranscriptionfactor1)基因的方法，具体步骤如下： (1)人工合成所述DNA序列及其互补链；将核酸片段插入到gRNA克隆质粒并通过大肠 杆菌T0P10转化，挑单克隆菌株，提取质粒，测序鉴定； (2) 分别将gRNA克隆质粒及hCas9质粒转化入大肠杆菌T0P10,培养过夜，提取细胞转 染质粒； (3) 将转染细胞培养基换为无血清培养基，将gRNA克隆质粒及hCas9质粒用培养基配 制成转染混合液，加入到转染细胞培养基中，5-6小时后，转染细胞培养基替换为血清培养 基继续培养2-3天，即得敲除BTF基因的转染细胞。
[0007] 本发明的第三方面是提供所述DNA序列在敲除BTF基因中的应用。
【具体实施方式】
[0008] 实施例1CRISPR/Cas9BTF-guideRNA质粒构建、细胞转染及突变鉴定 (1)CRISPR/Cas9BTF-guideRNA质粒构建 合成核苷酸序列 5 '-ITTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAGGAGGTAGATATC ATCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC-3 '，及其反向互补序列 5'-GACTAGCCTT ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCGATGATATCTACCTCCTCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGATATAT AAAGCCAAGAAA-3'。另外，设计其他gRNA序列用于对比，具体如下：对比序例1 :其gRNA序列 为TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTATTATCAAGGAGGAGGGTTTTAGAGCTAGAA ATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC;对比序列 2 :其gRNA序列为ITTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAA GGACGAAACACCAGACGACCTTATGGGTACAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC。将三 种gRNA核苷酸序列各自用去离子菌水配成100剛，置600ml沸水，自然室温冷却退火，形成 双链，分别克隆至gRNAcloning质粒。gRNA_cloning质粒载体骨架为pCR-BluntII-T0P0， 包含有U6启动子、guideRNAscaffold及末端信号序列，在U6启动子、guideRNAscaffold 之间有靶序列插入酶切位点Aflll，购自addgene公司（美国马萨诸塞州剑桥市)。Aflll酶 切gRNA_cloning质粒（addgene公司Plasmid#41824)，Gibsonassembly(NEBE2611)方 法将核酸片段插入到Aflll酶切线性化的gRNAcloning质粒（addgene#41824)。转化大肠 杆菌T0P10,挑单克隆菌株，提取质粒，测序鉴定。
[0009] (2)细胞转染转质粒提取 无菌操作分别挑取gRNA克隆及hCas9质粒（addgene#41815)转化大肠杆菌T0P10， 接种15ml50yg/ml抗生素Kan与100ug/mlAmp抗生素LB培养基，37°C培养过夜。按 PureLinkHiPurePlasmidDNAPurificationKits(lifetechnologiesK2100-06)说 明书提取细胞转染质粒，浓度要求大于1呢/沿。
[0010] (3)A549 细胞转染 选择肺癌A549作为转染细胞系。转染前一天将A549细胞接种6孔板，接种密度50%。 转染：各取lyggRNA与hCas9质粒，溶于100ylOpti-mem培养基，将2yllipo-2000溶 于100y1Opti-mem培养基中，混匀室温放置5min后混合，放置20min。将12孔板内培养 基换成无血清培养基，每孔lml，每孔200y1加入转染混合液。5-6小时换成37°C预热有 10%胎牛血清培养基DMEM。置37°C5%C02,90%湿度培养2-3天，收集细胞。
[0011] (4)细胞BTF突变鉴定 小量全血基因组DNA快速提取试剂盒操作说明，提取收集细胞基因组，以BTF-F5 ' -GTGTGTGTGTGITITGTGCC-3 '，BTF-R5 ' -ITGGACTCCTGGAACGTGAA-3 ' 为引物，PCR扩增BTF 片段，PCR扩增条件为：95°C3min; 94°C30s;56°C30s;72lmin50s;30 个循环；72°C延 伸lOmin，扩增产物约450bp。PCR产物以BTF-F或BTF-R作为测序引物进行DNA测序，在靶 点位置出现重叠峰即为造突变成功。将另一半细胞利用有限稀释法，分离单细胞，扩大培养 后，提取基因组，PCR扩增BTF突变区，产物经DNA测序鉴定，在BTF基因251-269bp处可见 突变重叠峰，说明敲除成功。而gRNA对比序列1，2按同样方法平行操作，未见BTF突变重 叠峰。
[0012] 实施例2转染后的A549细胞中BTF蛋白的检测 将实施例1经过转染、筛选得到BTF基因移码突变的细胞，接种至6孔板扩大培养，将 转染前A549细胞设为对照，加入100-200y13XSDS-PAGE上样缓冲液，沸水煮5-7分钟，取 10至20ul上样SDS-PAGE蛋白电泳。电泳完毕后，按照常规蛋白湿转，5%脱脂奶粉、0. 05M PBSPH7. 4封闭3hr，将封闭后的PVDF膜置于兔抗人BTF抗体（1:200,Abcam/abl81240,英 国剑桥科学园)，缓冲液为5%脱脂奶粉、0. 05MPBSPH7. 2,室温2hr或2-8°C过夜，用漂洗 缓冲液〇. 05MPBSPH7. 2、0. 1%Tween-20漂洗四次，每次5分钟，再将膜转移至0. 05MPBS PH7. 2、0. 2%Tween-20、1:5000稀释山羊抗兔二抗缓冲液（sigma/A0545,美国圣路易斯，密 苏里州），室温40-60min，再用漂洗缓冲漂洗四次，每次5min。漂洗完毕后将蛋白印迹膜用 ECL显影检测。BTF移码基因突变A549细胞中western-blot检测不到BTF蛋白条带，而对 照组则有BTF蛋白条带出现。另外，对比序列1和2转染的细胞经同样western-blot检测 发现有BTF蛋白条带出现。
【主权项】
1. 一种用于敲除人细胞 BTF (Bcl-2-associated transcription factor I)基因的 CRISPR/CAS guide RNA的靶DNA序列，所述序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -种采用权利要求1所述DNA序列敲除人细胞BTF (Bcl-2-associated transcription factor 1)基因的方法，具体步骤如下： (1) 人工合成所述DNA序列及其互补链；将核酸片段插入到gRNA克隆质粒并通过大肠 杆菌TOPlO转化，挑单克隆菌株，提取质粒，测序鉴定； (2) 分别将gRNA克隆质粒及hCas9质粒转化入大肠杆菌T0P10,培养过夜，提取细胞转 染质粒； (3) 将转染细胞培养基换为无血清培养基，将gRNA克隆质粒及hCas9质粒用培养基配 制成转染混合液，加入到转染细胞培养基中，5-6小时后，转染细胞培养基替换为血清培养 基继续培养2-3天，即得敲除BTF基因的转染细胞。3. 权利要求1所述DNA序列在敲除BTF基因中的应用。
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体提供了一种提供一种用于敲除细胞人BTF（Bcl-2-associated？transcription？factor？1）基因的sgRNA序列。在细胞中该gRNA能够特异结合于人BTF编码序列第251-269bp，并与Cas形成复合物，对BTF基因核酸序列进行特异切割，利用细胞非重组末端连接(NHEJ)修复机制，造成BTF基因移码突变，进而获得BTF基因敲除细胞。
【IPC分类】C12N15/11, C12R1/19, C12N15/70
【公开号】CN105112412
【申请号】CN201510586662
【发明人】邵长君, 王绪敏, 王延强, 于军
【申请人】中国科学院北京基因组研究所
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月14日