一种快速扩增猪圆环病毒2型全基因组序列的pcr方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明专利属于分子生物学领域，具体涉及猪圆环病毒2型全基因组序列快速扩 增方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒2型是猪圆环病毒病的主要病原，临床上常导致仔猪多系统衰竭综 合征、猪皮炎与肾病综合征、母猪繁殖障碍、间质性肺炎等表现，严重危害养猪业健康发展 (Zhaietal.，2014,VirologyJournal，11:88)。猪圆环病毒有猪圆环病毒1型和猪圆环 病毒2型两个型，其中猪圆环病毒2型又有多种基因型，如PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d及 PCV2e。猪圆环病毒1型对猪不致病，而猪圆环病毒2型对猪有致病性，是科学研究的重点。 猪圆环病毒无处不在，目前，在猪群、野猪群、人群、牛肉、啮齿类动物、生物制品、水环境等 中都有猪圆环病毒2型的存在。猪圆环病毒2型病毒株可以发生基因型间和基因型内的同 源重组（Zhaietal.，2014,VirologyJournal，11 :88)。然而，这些研究中扩增猪圆环病 毒2型的全基因组时，用到的扩增引物往往是多条引物，这往往会导致人为的同源重组产 生，同时，也不利于不同来源猪圆环病毒2型全基因组序列的快速扩增与获取。
[0003] 基于以上问题，公开一种快速、准确的猪圆环病毒2型全基因组序列快速扩增方 法很有必要。
【发明内容】
[0004] 本专利的目的在于运用分子生物学、生物信息学等方法进行引物设计、序列比对 及反应体系优化，提供猪圆环病毒2型全基因组序列快速扩增方法及其扩增引物对。
[0005] 本发明提供的猪圆环病毒2型全基因组序列快速扩增方法，其涉及的一对引物序 列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。
[0006] 本发明还提供猪圆环病毒2型全基因组序列快速扩增方法，包括以下步骤：
[0007] (1)提取猪圆环病毒2型的DNA ;
[0008] (2)用SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物对猪圆环病毒2型全基因组序列 进行PCR扩增；
[0009] (3)目的片段的回收、连接、转化、阳性菌的鉴定及测序；
[0010] ⑷利用DNAStar等生物信息学软件对所测定的序列进行比对分析、序列拼接，获 到猪圆环病毒2型得全基因组序列。
[0011] 其中，所述的50yLPCR反应体系包括：2XPCRMix(北京天根公司）25yL，上下游 引物各1yL，病毒DNA5yL，灭菌ddH20 18mL；
[0012] 其中，所述的PCR反应程序包括：94°C预变性2min，35个循环（94°C变性20s，63°C 退火 20s，68°C延伸 3min)，68°C再延伸 5min。
[0013]本发明将猪圆环病毒2型基因组序列分为1个片段扩增，将扩增的PCR片段克隆 至IjpGM-T载体上进行核酸测序。本发明可以在2个小时内（仅117分钟）快速有效地扩增 出目的片段，有利于研究猪圆环病毒2型的遗传进化、分子流行病学及感染性克隆等。
【附图说明】
[0014] 图1所示为扩增猪源猪圆环病毒2型的琼脂糖凝胶电泳图片。M:DNAMarker 2000 ;1 :猪源猪圆环病毒2型毒株；2 :阴性；
[0015] 图2所示为扩增水牛源猪圆环病毒2型的琼脂糖凝胶电泳图片。M:DNAMarker 2000 ;1 :水牛源猪圆环病毒2型毒株；2 :阴性；
[0016] 图3所示为扩增褐家鼠源猪圆环病毒2型的琼脂糖凝胶电泳图片。M:DNAMarker 2000 ;1 :阴性；2 :褐家鼠源猪圆环病毒2型毒株；
[0017] 图4所示为猪圆环病毒2型各基因型的遗传进化树。其中，Buffalol、Buffalo2 和Buffalo3是水牛源猪圆环病毒2型病毒株；RN1和RN2是褐家鼠源猪圆环病毒2型病毒 株。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，其操作步骤会进一步明确。
[0019] 优化实施例：
[0020] (1)病毒DNA抽提
[0021] 取经过PCR鉴定为猪圆环病毒2型阳性的水牛和褐家鼠样本，进行研磨、组织匀 浆，1 : 2进行稀释，反复冻融3次，按照病毒DNA提取试剂盒（Axygen公司）进行DNA抽 提，最后，用50~100yLRNase-free双蒸水进行DNA洗脱，保存于-20°C冰箱；
[0022] (2)引物设计与合成
[0023] 通过猪圆环病毒2型多个基因型全基因组序列的比对，应用PrimerPremier5.0 软件设计1对引物（苏州金唯智生物科技有限公司化学合成），具体引物序列如表1所示。 "F"代表正向引物，"R"代表反向引物。
[0024] 表1引物信息
[0025] (3)PCR扩增
[0026] 猪圆环病毒2型全基因组进行一次扩增，引物如SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所 示。50yLPCR反应体系包括：2XPCRMix(北京天根公司）25yL，上下游引物各lyL，病毒 DNA5yL，灭菌ddH20 18mL；
[0027] PCR反应程序包括：94°C预变性2min，35个循环（94°C变性20s，63°C退火20s， 68°C延伸 3min)，68°C再延伸 5min。
[0028] (4)目的基因片段的回收
[0029] PCR胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，具体回收方法如下：
[0030] ①.柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500 ii 1的平衡 液BL，12,OOOrpm(~13, 400Xg)离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回 收集管中。②.估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀（无 需去除石蜡油或矿物油）。③.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收 集管中），室温放置2min，12,OOOrpm(~13, 400Xg)离心3〇-6〇sec，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱CB2放入收集管中。④.向吸附柱CB2中加入600y1漂洗液PW，12,OOOrpm(~ 13,400Xg)离心3〇-6〇sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。⑤.重复 操作步骤④。⑥.将吸附柱CB2放回收集管中，12,000印111(~13,400\8)离心21^11，尽 量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响 下一步的实验。⑦.将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 30-50y1洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,OOOrpm(~13, 400Xg)离心2min收集DNA 溶液。
[0031] (5)将目的基因片段连接到pGM-T载体上：
[0032] 具体操作方法如下：在0.2mlPCR管中加入目的DNA3yl，10XT4DNA连接酶 1yl，pGM-T克隆载体1yl，ddH20 5y1，轻轻混勾，于22°C连接l-2h。反应结束后，将管置 于冰上冷却。
[0033] (6)连接产物的转化
[0034] 取5^1连接产物加到50-100 ^11'0?10感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30111111;然 后将离心管置于42°C水浴90sec，取出管后立即置于冰浴中放置2-3min，其间不要摇动离 心管；向离心管中加入250-500yL37°C预热的LB(不含抗生素）培养基，150rpm，37°C振荡 培养lh。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏；将离心管中的菌液混匀， 吸取100yL加到含氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻棒轻 轻地将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37°C培养12-16h;将得到的白色菌落 接种到4mLLB液体培养基中，37°C摇床振荡培养12-16h，保存菌种后，待质粒提取。
[0035] (7)阳性质粒的鉴定
[0036] 取少许质粒进行PCR扩增，见⑶描述。
[0037] (8)序列测定
[0038] 对鉴定为阳性的质粒，送北京六合华大基因科技股份有限公司广州测序部进行测 序。
[0039] (9)序列拼接
[0040] 使用DNAStar软件中的SeqMan程序，将测序结果进行序列拼接、编辑及校正。同 时，结合测序峰图对不同批次的测序结果进行碱基校对，最终获得水牛源和褐家鼠源猪圆 环病毒2型全基因组（1768bp或1767bp)。
[0041] PCR的特异性试验
[0042] 以优化好的PCR反应体系及条件，对猪圆环病毒2型、猪博卡病毒1型、2型、3型、 伪狂犬病毒、猪蓝耳病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪细环病毒等进行PCR 扩增，来检测该方法的特异性。结果仅有猪圆环病毒2型出现阳性结果，如表2所示。
[0043] 表2PCR的特异性试验
[0044]
[0045] ^表2所示为用于扩增猪圆环病' 2型全基因组PO?方^的特异性实验结果〇PCV2 ： 猪圆环病毒2型；PBoVl:猪博卡病毒1型；PBoV2 :猪博卡病毒2型；PBoV3 :猪博卡病毒3 型；PRV:伪狂犬病毒；PRRSV:猪蓝耳病病毒；PPV:猪细小病毒；CSFV:猪瘟病毒JEV:乙型 脑炎病毒；TTSuV:猪细环病毒；+ :阳性；-:阴性；
[0046] PCR的敏感性试验
[0047] 测定一株猪圆环病毒2型阳性重组质粒的模板浓度为95. 6yg/ml，然后进行倍比 稀释，来测定该方法的敏感性，最小可检测浓度达到95. 6pg/ml，如表3所示。
[0048] 表3扩增猪圆环病毒2型全基因组PCR方法的敏感性实验结果
[0049]
【主权项】
1. 一种快速扩增猪圆环病毒2型全基因组序列的PCR方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 提取猪圆环病毒2型的DNA ; (2) 配置50 y L PCR反应体系，用引物对猪圆环病毒2型全基因组序列进行PCR扩增； (3) 目的片段的回收、连接、转化、阳性菌的鉴定及测序； (4) 利用DNAStar等生物信息学软件对所测定的序列进行比对分析，得到猪圆环病毒2 型全基因组序列。2. 如权利要求1所述的PCR方法，所述引物的序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所 不。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：50yL PCR反应体系包括：2XPCR Mix 25 11]^，上下游引物各111]^，病毒0嫩5 11]^，灭菌(1(11120 181]1匕4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：PCR扩增包括：94°C预变性2min，35个循环 (94°C变性 20s，63°C退火 20s，68°C延伸 3min)，68°C再延伸 5min。
【专利摘要】本发明公开了一种快速扩增猪圆环病毒2型全基因组序列的PCR方法。用于扩增猪圆环病毒2型全基因组序列的引物，包括如SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2所示的引物。本发明特异性强，敏感度高，可以快速有效地扩增出目的片段，有利于研究不同动物来源猪圆环病毒2型的遗传进化、分子流行病学及感染性克隆等。
【IPC分类】C12Q1/70, C12R1/93, C12Q1/68
【公开号】CN105112560
【申请号】CN201510500330
【发明人】翟少伦, 魏文康, 温肖会, 吕殿红
【申请人】广东省农业科学院动物卫生研究所
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月14日