他莫西芬抗肿瘤药物敏感度检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种分子生物技术领域的药物敏感度检测方法，包括引物、探针 及其试剂盒，具体是一种用于他莫西芬抗肿瘤药物敏感度检测的方法，针对他莫西芬药物 使用者基因内3个生物标记的引物、探针及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 化疗在目前是恶性肿瘤治疗的重要手段，临床化疗的效果对于肿瘤患者的治疗和 提高生存期有着至关重要的影响。对于不同的患者，不同的化疗药物的效果差异很大。肿 瘤患者对化疗的反应不同，很多时候是由于对化疗药物敏感性存在差异。由于临床医生往 往只能凭经验对不同患者使用某种化疗药物或化疗方案，带有一定的盲目性，因此很多肿 瘤患者的化疗效果并不理想，往往达不到化疗的预期目的。所以，一个能够在化疗前筛选出 针对性强、患者敏感度较高化疗药物的检测方法，对于提高个体化治疗效果，提高化疗的成 功率，有着重要的意义。
[0003] 近年来国内外肿瘤和化疗药物研究领域相继创建了一系列体内或体外预测肿瘤 化疗药物敏感性的方法。常用的有裸鼠皮下移植药敏测定法、人体肿瘤细胞集落测定法、 放射性标记代谢物前体掺入法、MTT比色、三磷酸腺苷法和快速荧光分析等等。这些方法均 存在一些缺点，要么费用昂贵且检测周期长，不适合常规使用；要么需要在体外培养原发肿 瘤，检测成功率低。这些缺陷把肿瘤化疗药敏实验限制在了研究性的实验室里，很少有大规 模使用的报道。
[0004] 药物基因组学（pharmacogenomics)研究的进展为从分子水平研制和开发新一代 的，针对药物敏感性进行检测的方法提供了理论基础和大量的实验数据。实验证明，个体基 因水平上的差异，包括基因多态性、基因突变和表达差异等，与肿瘤患者对药物的敏感性密 切相关。通过检测患者在这些基因上与药物敏感性相关的生物标记，可以预测患者对肿瘤 化疗药物的敏感性，帮助进一步指导选择合理的化疗方案。我们通过设计试剂盒，检测人类 基因上的多个SNP生物标记，可以方便、快速的预测他莫西芬药物对患者个体的疗效。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是利用SNP标记检测方便快捷，准确率高的优点，采用Seqnome检测 技术，提供一种用于他莫西芬抗肿瘤药物敏感度检测的方法，包括PRC引物、延伸引物和试 剂盒。
[0006] 本发明涉及一种用于他莫西芬抗肿瘤药物敏感度检测的PCR扩增引物，含有SEQ ID No. 1 ~3所示的上游引物和SEQ ID No. 4~6所示的下游引物。
[0007] 本发明涉及一种用于他莫西芬抗肿瘤药物敏感度检测的单碱基延伸引物，含有 SEQ ID No. 7~9所示的单碱基延伸引物。
[0008] 本发明设计一种试剂盒，由PCR扩增试剂组、SAP酶试剂组和iPLEX试剂组构成， 其中PCR扩增试剂组含有：PCR缓冲液、MgCl 2、dNTP混合液、Hotstar Taq酶、纯水和如SEQ ID No. 1 ~3所示的上游引物和如SEQ ID No. 4~6所示的下游引物；SAP酶试剂组含有：SAP 缓冲液、SAP酶和纯水；iPLEX试剂组含有：iPLEX缓冲液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、纯 水和如SEQ ID No. 7~9所示的单碱基延伸引物。
[0009] 上述标记组合优选利用飞行质谱（MALDI-T0F)方法进行检测，检测方法包括以下 步骤（1)提取基因组DNA，包括提取抗凝血DNA和口腔上皮细胞DNA ; (2)飞行质谱检测SNP 多态；（3)根据SNP分型结果推断他莫西芬药物敏感度。
[0010] 本发明对ABCB1基因上的三个SNP生物标记进行分型，建立了一个快速，简便，且 成本低廉的检测试剂盒，该试剂盒准确度高，灵敏性好，具有很强的实用价值。 实施例
[0011] 以下实施例，对本发明的【具体实施方式】进行详细描述，实施例用于说明本发明，但 不用来限制本发明的范围，实施例1 :采用飞行质谱方法对肿瘤患者进行SNP分型及他莫西 芬药物敏感度检测方法： 一） 提取基因组DNA :本试验的样本是使用刮棒采集的口腔粘膜细胞，室温保存。刮棒 采样DNA提取的具体步骤如下： 1) 将口腔刮棒上的脱落细胞溶于400 yL IX裂解液中，加入1 yL蛋白酶K，56度水浴 30分钟； 2) 取出样品置冰水浴1分钟，加入6mol/L NaCl 150 y L，剧烈振荡15-20秒，13000转 离心10分钟； 3) 吸取上清液至新的离心管中，加入1. lmL无水乙醇，上下颠倒10次至絮状DNA沉淀 出现。室温放置10分钟，13000转离心2分钟沉淀DNA ; 4) 弃去上清液，再加入0. 25mL70%乙醇洗涤DNA沉淀，室温放置1分钟后，13000转离 心5分钟； 5) 用移液器小心吸取乙醇，然后放入通风橱中通风10分钟，然后用35yL TE溶解DNA ; 6) DNA可在4度保存1-2个月，或者存放在-20度长期保存； 7) 使用18PL PCR Master Mix反应液以及2ML DNA模板，PCR扩增0-actin片断， 1. 5%琼脂糖凝胶，120V电泳15分钟，观察结果合格后转移至PCR管中； 8) 紫外分光光度计SMA3000测定溶液中DNA的浓度和A260/A280比值，测量3次取平均 值，浓度应在30ng/ y L，A260/A280比值应该在1. 7-2. 0之间，合格的DNA 4°C取用或_20°C 保存； 二) 飞行质谱检测SNP多态，采用本发明中所述试剂盒对样本中的SNP生物标记进行检 测，下面为检测过程： 1) 引物与DNA稀释以及质检：PCR引物稀释至终浓度为0. 5 yM ;根据Sequenom的稀释 公式，按照单碱基延伸引物的分子量将引物稀释至终浓度为7-14 iiM之间； 2) PCR扩增：在每个384孔PCR板中加入1 y L DNA和4 y L PCR扩增试剂，共5 y L，按 照PCR仪程序1进行扩增： PCR 耜序 1，94°C
1Bmin 56°C 30sec 45 cycles 72 °C lmin 72 °C 3min 4°C 00 PCR扩增结束后，将384孔板短暂离心后备用，可在4°C保存； 3) SAP酶处理：在PCR扩增后的产物加入2ML的SAP酶试剂，共7ML。按照PCR仪程序 2进行扩增： -**^PCR 程序 2 :37°C，40min 85〇C,5min 4°C, ^ SAP酶处理结束，将384孔板取出短暂离心备用； 4) iPLEX延伸：在SAP酶处理后的产物加入2ML的iPLEX试剂，共9ML。按照PCR仪程 序3进行扩增； PCR 程序 3:94°C 30sec
iPLEX延伸结束，将384孔板取出短暂离心备用； 5) 树脂纯化与数据收集 将反应产物(共9 y L)加入25 y L水进行稀释，使用树脂进行脱盐；将脱盐处理后的样 品点在芯片靶点上，自然结晶，上机进行质谱检测，并收集数据； 三）根据SNP分型结果推断他莫西芬药物敏感度： 根据肿瘤患者样品DNA中3个SNP生物标记的分型结果，我们对患者他莫西芬药物敏 感度进行评价，如果样品DNA中含有对他莫西芬药物耐药的基因型，我们将对患者进行风 险提不。
【主权项】
1. 一种用于他莫西芬抗肿瘤药物敏感度检测的PCR扩增引物，其特征在于，包含SEQ ID No. 1 ~3所示的上游引物和SEQ ID No. 4~6所示的下游引物。2. -种用于他莫西芬抗肿瘤药物敏感度检测的引物单碱基延伸引物，其特征在于，包 含SEQ ID No. 7~9所示的单碱基延伸引物。3. -种用于他莫西芬抗肿瘤药物敏感度检测的方法，其特征在于，由PCR扩增试剂组、 SAP试剂组、iPLEX试剂组构成，包括： 1. PCR扩增试剂组含有：PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合液、Hotstar Taq酶、纯水和如 SEQ ID No. 1 ~3所示的上游引物和如SEQ ID No. 4~6所示的下游引物； 2. SAP酶试剂组含有：SAP缓冲液、SAP酶和纯水； 3. iPLEX试剂组含有：iPLEX缓冲液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、纯水和如SEQ ID No. 7~9所示的单碱基延伸引物。4. 根据权利要求3所述方法制造的系列试剂盒，包括： 1) 根据权利要求3所述方法制造的试剂盒，其特征是，所述的PCR扩增缓冲液为10 X 缓冲液，含2mM MgCl2; 2) 根据权利要求3所述方法制造的试剂盒，其特征是，所述的MgCl2浓度为2mM ; 3) 根据权利要求3所述方法制造的试剂盒，其特征是，所述的dNTP混合液的浓度为 500 y M ; 4) 根据权利要求3所述方法制造的试剂盒，其特征是，所述的Hotstar Taq酶为0. 5U ; 5) 根据权利要求3所述方法制造的试剂盒，其特征是，所述的SAP缓冲液为IOX缓冲 液； 6) 根据权利要求3所述方法制造的试剂盒，其特征是，所述的SAP酶为I. 7 U/ y L的虾 碱性磷酸酶； 7) 根据权利要求3所述方法制造的试剂盒，其特征是，所述的iPLEX缓冲液IOX缓冲 液； 8) 根据权利要求3所述的方法制造的试剂盒，其特征是，所述的ddNTP混合液为经过 质量修饰的核苷酸； 9) 根据权利要求3所述的方法制造的试剂盒，其特征是，所述的单碱基延伸酶为iPLEX 聚合酶。
【专利摘要】一种分子生物技术领域的用于他莫西芬抗肿瘤药物敏感度检测方法包括引物、探针及以此制造的试剂盒，该试剂盒由PCR扩增试剂组、SAP酶试剂组、iPLEX试剂组构成。PCR扩增试剂组含有：PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合液、Hotstar？Taq酶、纯水和如SEQ？ID？No.1~3所示的上游引物和如SEQ？ID？No.4~6所示的下游引物；SAP酶试剂组含有：SAP缓冲液、SAP酶和纯水；iPLEX试剂组含有：iPLEX缓冲液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、纯水和如SEQ？ID？No.7~9所示的单碱基延伸引物。利用该项技术将肿瘤患者的DNA提取并处理后，利用飞行质谱方法，检测引物扩增片段内的生物标记，并基于检测结果评价肿瘤患者对他莫西芬药物的敏感度，结果准确，灵敏度高，方法快速简便并且有很高通量。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105132564
【申请号】CN201510590488
【发明人】王健, 郭景康
【申请人】上海大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月17日