一种抑制柑橘溃疡病菌生长的化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系， 更具体的说，是探索化合物对柑橘溃疡病菌的抑菌和杀菌活性。
【背景技术】
[0002] 柑橘是重要的热带亚热带果树，生产分布广泛，全世界有145个国家生产柑橘，产 量居世界水果之首。据FA0统计，2011年世界W橘总产量达到1. 29亿吨，占世界水果总产 量的21. 2%。中国是世界第一大柑橘生产国，据国家农业统计数据，2011年柑橘栽培面积达 3432. 5万亩，产量达2944万吨。柑橘在我国热带、亚热带地区的19个大陆地区省（市、区） 广泛栽培，其中湖南是最大的柑橘生产省份，2011年面积达到586. 2万亩，产量达到420. 4 万吨。柑橘己经成为我国南方最主要的农业产业支柱之一。然而，与其他农作物一样，柑橘 也受到各种病虫生物的为害，目前在我国柑橘上为害最为严重的是黄龙病和溃疡病。这两 个病均是检疫性细菌病害。黄龙病主要在热量较高的华南柑橘产区为害严重，在湖南大多 数地区其传播媒介一一木風不能越冬，所以该病仅在靠近华南的湘南地区有零星发病。柑 橘溃疡病在我国最早于1919年有发病报道，随后蔓延至多省柑橘主产区。现在15个省区 有发生，其中广东、广西、福建、江西、浙江、湖南、台湾等主产省及云南、贵州等柑橘产区发 生较普遍，在其他地区有零星分布。
[0003]柑橘溃疡病最初在湖南仅少数地区发病严重，但是，随着生产上感病的甜橙类品 种的大力发展，使得该病在全省范围内蔓延来。据调查，湖南省已有65个县市发病，疫区县 市占全省总县市的57. 5%，甜橙和柚发病果园占43% (李大志等，2005)。目前，随着甜橙等 高感病优良品种的推广，病害还在不断扩展。
[0004] 柑橘溃疡病为害后，在柑橘叶、枝和果实上形成火山口状的病斑，严重时引起落 叶、落果，树势衰退，直接影响柑橘的生长结果，特别是果实感病后，失去鲜销商品价值。由 于病原菌可以随果实传播，因此，受检疫法的限制，溃疡病疫区的果实不能出售到有柑橘生 产的非疫区的任何市场，严重制约了疫区果实的市场开拓。非疫区的欧盟2010年进口柑橘 鲜果876. 73万吨，占世界柑橘鲜果进口总量的65. 3%，进口总值占世界的70. 5%，由于欧盟 有西班牙、意大利、法国等柑橘生产国，所有溃疡病疫区的柑橘果实均无法进入欧盟，失去 了一个非常重要的国际市场。重庆是目前我国建设的第一个非疫区，严禁调入任何疫区包 括加工甜橙在内的甜橙果实。因此，由该病害所造成的国内外市场开拓的限制给我国柑橘 产业造成了较大的损失，该病已成为湖南等亚热带柑橘产区，特别是甜橙主栽产区最主要 的危险性病害，在南亚热带和热带地区也是与黄龙病具有相同重要性的危险性病害。
[0005] 前人研究表明，柑橘溃疡病菌生长温度范围是12~40°C，在42°C时没有病症出现。 目前，多数报道认为最适宜溃疡病菌的的生长温度是20~30°C，极限温度最低为5°C，最高 为35°C;最有利的湿度条件是50%以上。暴风雨和台风过后，易发病。柑橘溃疡病主要危 害柑橘地上部分的组织，包括幼嫩的叶片、茎段和果实。在适宜的发病条件下，病斑首先在 叶片远轴面形成油状突起，随着病原菌诱导的组织增生，油状凸起破裂，并继续增长，继而 形成火山口状凸起，也就是典型的溃疡病病斑。病斑影响果实外观，严重时因为影响叶片光 和作用而使树势减退。如果环境条件不适宜，典型症状的出现至少需要60d以上。
[0006] 病原菌在病叶、病枝或病果内潜伏，遇水从病部溢出，并通过风雨条件扩散至没有 感染的部位，经气孔，伤口等通道侵入寄主叶肉细胞间隙。叶片、果实和嫩枝均能感病，形成 的病斑遇到风雨天气后加速生长，病原菌最终从病斑处溢出至寄主表面，遇到合适的环境 条件形成新一轮侵染。在不同地区，由于气候条件和柑橘物候期的不同，发病时间会有较大 差异。在亚热带地区，以前春梢和秋梢很少发病，主要是夏梢易发病，生产上常釆用抹除夏 稍的办法来控制溃疡病。但是，最近几年来，大多数甜橙园春梢也发病，部分地区的冰糖橙 果园有时候还很严重。现在栽培上多釆用控夏梢促早秋梢的措施，以获得大量好的结果母 枝，避免夏梢感病和引起落果的增加。各地放秋梢的时间不一，但多在7~8月份抽生秋梢， 最迟在9月上旬。这样一来，秋稍抽生期也恰逢高温季节，故秋梢现在也易发病。
【发明内容】
[0007] 本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对柑橘溃疡病菌的生物活性。
[0008] 本发明的具体技术方案如下： 本发明的创新点是发现化合物对柑橘溃疡病菌有良好的抑菌和杀菌活性，并测量得到 其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。
[0009] 所述化合物结构特征如下式所示：
【具体实施方式】
[0010] 下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明范围。
[0011] 实施实例1 测量最小抑菌浓度MIC值。
[0012] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0013] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0014] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0015] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50 y L，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
[0016] 计算公式为：菌液浓度=nX20X100cfu/mL (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0017] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小抑菌浓度MIC(MinimalInhibitoryConcentration)。MIC为最小抑菌浓度，即药物 与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。
[0018] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同浓度的药液和100yL 菌液，使最终菌液浓度为1~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第 12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物最 低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC，每个实验重复三次。
[0019] 测得最小抑菌浓度MIC值为8yg/mL。
[0020] 实施实例2 测量最小杀菌浓度MBC值。
[0021] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0022] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0023] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0024] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50 y L，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓 度=nX20X 100cfu/mL。
[0025] (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0026] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小杀菌浓度MBC(MinimalBactericidalConcentration)。在MIC基础上，从每管吸取 10yL溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，以完全杀灭细菌的最低浓度 为最小杀菌浓度(菌落数小于等于5)。
[0027] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256 yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加lOOyL不同浓度的药液和lOOyL 菌液，使最终菌液浓度为l~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照， 第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物 最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取 10 y L接种于营养琼脂平板上，做好标记，于28°C培养24h，以仍无细菌生长的管内药物浓 度记为该药的MBC，每个实验重复三次。
[0028] 测得最小杀菌浓度MBC值为32 y g/mL。
【主权项】
1. 一种抑制柑橘溃疡病菌生长的化合物，其特征在于： (1) 结构特征如下式所示：(2) 其可作为柑橘溃疡病菌的抑制剂和杀菌剂； (3) 其对柑橘溃疡病菌的最小抑菌浓度MIC值为8 μ g/mL ; (4) 其对柑橘溃疡病菌的最小杀菌浓度MBC值为32 μ g/mL。
【专利摘要】本发明发现对柑橘溃疡病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其柑橘溃疡病菌的最小抑菌浓度MIC值为8μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为32μg/mL。
【IPC分类】A01N43/86, C07D413/04, A01P3/00
【公开号】CN105153140
【申请号】CN201510730268
【发明人】不公告发明人
【申请人】许自协
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年11月2日