交联后的四膜虫小核的分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于纯化交联后的四膜虫，尤其是嗜热四膜虫的小核，尤其是新月期小核的分离方法。
【背景技术】
[0002]现有的四膜虫大小核的分离方法一般是在机械破碎后通过差速离心或密度梯度沉降的方式进行大小核的分离。主要是针对活细胞进行操作，操作的时间较长且不适合分离新月期小核，因为新月期小核由原本的圆形小核极度延伸后成为线形的小核，在机械破碎时容易破碎。另外由于甲醛等交联后的细胞难以进行机械破碎，所以目前的实验方法不适用于交联后的细胞。
[0003]嗜热四膜虫是一个很好的研究模型，然而不能对交联后的细胞进行有效的裂解和小核的分离，以及难以得到较好的新月期小核。使得针对小核的相关实验(ChIP，H1-C)难以有效开展。为更好的研究如小核在接合生殖中转录活性短暂恢复等问题，需要建立一种可以用于交联后的嗜热四膜虫小核分离的方法。
【发明内容】
[0004]本发明主要针对交联后的嗜热四膜虫进行小核的分离，特别适用于一个特殊时期(新月期)小核的分离，可用于后续的H1-C，ChIP-Seq等实验。就H1-C实验而言，这是一种可用于全基因组水平染色质构象及相互作用研究的技术，在近几年得到了广泛的关注。四膜虫有两个细胞核，且大核中染色体有多个拷贝不适用于H1-C实验的后续分析研究，故而需要分离纯化出其小核用于后续实验研究，另外四膜虫的新月期小核是研究染色质构象变化的一个很好的材料。因此本发明为嗜热四膜虫中的H1-C及相关研究提供了可行性。
[0005]本发明在用交联剂如甲醛对嗜热四膜虫细胞进行交联处理后，通过化学裂解法裂解细胞，最终通过离心法分离嗜热四膜虫的小核。本发明的技术方案包括:1)使用交联剂如甲醛对嗜热四膜虫细胞进行交联处理；2)用化学裂解液处理嗜热四膜虫细胞使其细胞膜易破碎；3)使用SDS裂解细胞；4)通过多次离心的方式除去大核，最终得到嗜热四膜虫的小核。
[0006]本发明技术通过用交联剂固定细胞，使用化学方法裂解细胞后进行大核和小核的分离。不仅能得到普通的圆形小核，也能分离出处于嗜热四膜虫有性生殖中新月期的线性小核。
[0007]具体而言，本发明包括以下各项:
[0008]1.一种分离四膜虫的小核的方法，所述方法包括:
[0009]I)使用交联剂对四膜虫细胞进行交联处理；
[0010]2)使用SDS裂解细胞；
[0011]3)离心除去大核，得到小核。
[0012]2.根据I所述的方法，所述方法还包括在步骤2)之前用细胞裂解液处理四膜虫细胞的步骤。
[0013]3.根据权利要求1所述的方法，其中所述四膜虫是嗜热四膜虫。
[0014]4.根据I所述的方法，其中所述交联剂是甲醛。
[0015]5.根据I所述的方法，其中所述细胞裂解液具有如下组成:20mM Tris-HClpH8.0, 10mM NaCl，20mM KCl, 1.5mM MgC12,1% NP-40。
[0016]6.根据5所述的方法，其中所述细胞裂解液还包含蛋白酶抑制剂混合物。
[0017]7.根据I所述的方法，其中所述小核为新月期小核。
[0018]8.根据I所述的方法，其中步骤3)中的裂解步骤需要将细胞分散成单细胞。
[0019]9.根据I所述的方法，其中步骤3)中的裂解时间为10-15分钟，优选为12分钟。
[0020]10.根据I所述的方法，其中重复步骤4)中的离心步骤数次。
[0021]本发明具有以下优点和积极效果:
[0022]现有的分离方法主要用于嗜热四膜虫活细胞中的大小核的分离，且不适用于新月期小核的分离。我们建立的嗜热四膜虫的小核分离的方法主要是针对H1-C，ChIP等实验，需要对细胞进行甲醛的固定处理。另外，我们的分离方法不仅可以分离出一般的圆形小核，也可以用于特殊的新月期小核的分离。这一方法的建立，使得针对嗜热四膜虫小核的H1-C，ChlP-seq等实验可以进行。从而为嗜热四膜虫小核的基因组功能研究提供了方便。
【附图说明】
[0023]图1.嗜热四膜虫接合生殖中新月期小核的分离。
【具体实施方式】
[0024]本发明通过以下方式来实现。
[0025]1.样品收集及保存
[0026]1.取接合后3小时，即新月期的四膜虫，密度约为2.5xl05个细胞/ml，加37%的甲醛至终浓度I %，混匀，室温10分钟。
[0027]2.加入2.5M的甘氨酸至终浓度为125mM以中和甲醛，混匀，室温放置5分钟，冰上放置15分钟。
[0028]3.1500g，4摄氏度离心2分钟，去上清，用1mM的Tris-HCl清洗一次。再次离心去上清O
[0029]4.转移到1.5ml的离心管中，每管约2xl07个细胞，2000g，4摄氏度多次离心，尽可能除去残留的液体。样品可保存在-80摄氏度或直接用于后续的实验。
[0030]I1.细胞裂解及新月期小核分离
[0031]1.取-80摄氏度保存的四膜虫样品(2xl07个细胞/管)，将每一管样品，重悬于Iml 的细胞裂解液(20mM Tris-HCl ρΗ8.0，10mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgC12,1% NP-40，使用前加入Ix蛋白酶抑制剂混合物(Roche货号:Cat.N0.11873580001))中，4摄氏度旋转裂解I小时。
[0032]2.2000g，4摄氏度离心除去上清，用500ul预冷的细胞裂解液清洗一次，离心后除去裂解液。
[0033]5.用400ul 0.5%的SDS重悬细胞，重悬时尽量使细胞分散成单细胞，避免过多的细胞成团聚集，在62摄氏度下震荡处理约12分钟。
[0034]6.加入 200ul 10% Triton X-1OO 和 200ul 水中和 SDS，混匀。
[0035]7.780g，4摄氏度离心12分钟，小心转移上清至新的离心管中(小核)，780g，4摄氏度再次离心12分钟，转移上清至新的离心管中(除去残留的大核，可多重复几次)。
[0036]10.取部分用于DAPI染色鉴定小核分离的效果(如图1所示)。剩下的样品20000g，4摄氏度离心12分钟，弃上清，沉淀为小核。
[0037]分析结果(图1)中，Lysis是在细胞裂解后的裂解效果图既有线性的新月期小核和圆形的小核，也有圆形的大核。MIC_1，2，3是最终纯化得到的小核的效果图，基本都是圆形和线性的小核，大核污染很少。因此，证明本发明对于分离小核，尤其是新月期小核非常有效。
【主权项】
1.一种分离四膜虫的小核的方法，所述方法包括: 1)使用交联剂对四膜虫细胞进行交联处理； 2)使用SDS裂解细胞； 3)离心除去大核，得到小核。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在步骤2)之前用细胞裂解液处理四膜虫细胞的步骤。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述四膜虫是嗜热四膜虫。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述交联剂是甲醛。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞裂解液具有如下组成:20mMTris-HClpH8.0, 10mM NaCl，20mM KCl, 1.5mM MgCl2,1% NP-40o6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞裂解液还包含蛋白酶抑制剂混合物。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述小核为新月期小核。8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)中的裂解步骤需要将细胞分散成单细胞。9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)中的裂解时间为10-15分钟，优选为12分钟。10.根据权利要求1所述的方法，其中重复步骤4)中的离心步骤数次。
【专利摘要】本发明涉及一种交联后的四膜虫小核的分离纯化方法，具体是在用交联剂如甲醛对四膜虫细胞进行交联处理后，通过化学裂解法裂解细胞，最终通过离心分离四膜虫的小核。为嗜热四膜虫中的Hi-C及相关研究提供了可行性。
【IPC分类】C12N5/07
【公开号】CN105200004
【申请号】CN201510642078
【发明人】宋晓元, 罗正誉
【申请人】中国科学技术大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月30日