一株产乙基长春胺的夹竹桃科内生真菌ch1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物技术领域，特别设及一株产乙基长春胺夹竹桃科的内生真菌 CH1的培养及其代谢产物的应用。
【背景技术】 W02] 长春胺类生物碱，是近几年新兴的一种重要生物碱，其包含了长春胺 (Vincamine)、长春西汀（vinpocetine)、长春质碱（catharanthine)、乙基长春胺（ethyl vincaminate)等多种具有要药用价值生物碱。长春生物碱类具有预防和治疗缺血性屯、脑血 管疾病及其合并症、改善视力等多种药理作用。
[0003] 目前国内外主要的长春生物碱制备方法=种：植物提取、化学合成与细胞培养技 术。
[0004] 化iscuC等人报道了从长春花鲜草中提取脱水长春胺类生物碱的方法，该方法虽 然操作过程简单，但长春碱的收率极低，工业成本较高且不能满足社会需求。 阳0化]公开号为CN102164921B的发明专利介绍了用化学合成制备长春西汀和阿扑长 春胺的方法，该方法原料稀缺，并产生多个终产物和副产物的混合物，从而增加了整个方法 的时间和成本。
[0006] Eliz油ethMcCoy等通过在长春花细胞培养体系中添加不同的色氨酸衍生物获得 了不同于原长春花中生物碱的新的吗I噪生物碱，但是，长春花中吗I噪生物碱种类多，合成代 谢途径复杂，长春碱的收率极低。 阳007]本发明从夹竹桃中分离到一株产乙基长春胺夹竹桃科内生真菌，并对该菌株发酵 代谢产物进行研究。该发明为产长春生物碱解决了原料稀缺的问题并提供了一种新的研究 方向和思路。
[0008]
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是针对的长春生物碱生产过程的不足，提供一种从夹竹桃中分离筛 选出的产乙基长春胺内生真菌的方法。该方法反应过程溫和，产率较高，能有效降低生产成 本。
[0010] 为了解决前述技术问题，本发明提供了一种产乙基长春胺内生真菌的方法。本发 明所述的内生真菌是从夹竹桃植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的。命名为 CH1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏日：2014年12月，保 藏登记号为CCTCCM2014676。
[0011] 本发明所述的内生真菌的固体培养特征为：在培养基上27±2°C培养，生长较缓 慢，呈福射状，表面疏松、平坦；菌落颜色初为白色，后颜色逐渐变深最终为紫黑色，正反面 颜色不同，有气生菌丝；霉味。
[0012] 本发明目的通过W下技术方案来实现：
[001引（1)菌种分离与活化：将经过预处理的植物组织在无菌条件下切成Icmxlcm小 块，转接在制备好的分离培养基上，于27°C倒置培养至菌丝覆盖培养皿，待组织块周围长出 菌丝后挑取尖端部分，继续接种培养。取实验室保存的夹竹桃科内生真菌菌种，在洁净工 作台处操作，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体培养基，于27±2°C倒置培养至菌 丝覆盖培养皿；培养基组成成分为；上豆：10~20%、葡萄糖：1 %~5%、薦糖1 %~5%、 MgS041%。~5%。，牛肉膏1%~5%，氨基酸1%。~5%。，所述氨基酸是脯氨酸、色氨酸、谷氨酷 胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中的一种或多种。
[0014] (2)发酵培养：取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体种子培 养基中，27±2°C下摇床培养，得种子发酵液；无菌条件下，按照10%的接种量接种于灭菌 处理过的液体培养基中，27 + 2 °C下间歇性震荡培养6~8天； 阳01引（3)产物处理：发酵完毕，超声处理30~45min;过滤，菌液减压蒸干至100~ 150ml，有机溶剂萃取，菌丝干燥后粉碎，有机溶剂萃取，合并有机相，减压浓缩可得乙基长 春胺、长春西汀等长春胺类化合物。所述萃取所用的溶剂为石油酸、=氯甲烧、苯、正己烧中 的一种。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] -是本发明从夹竹桃树皮中分离筛选出一株产乙基长春胺内生真菌CH1，运为乙 基长春胺等长春胺生物碱的开发提供了一种新的研究思路；
[0018] 二是本发明提供了利用内生真菌发酵获得定向活性代谢产物的方法；为生产长春 胺类生物碱开发增添了新的途径。
【附图说明】
[0019]图1本发明所述夹竹桃科内生真菌在平板培养基上的形态图。
[0020] 图2本发明所述夹竹桃科内生真菌在液体培养基中的形态图。
[0021]图3本发明所述夹竹桃科内生真菌的微观形态图。
[0022] 图4本发明所述内生真菌次级代谢产物中乙基长春胺与标准品HPLC比对图谱。
[0023] 图5本发明所述夹竹桃科内生真菌菌丝体次级代谢产物中乙基长春胺的LC-MS图 谱。
【具体实施方式】
[0024] 本发明中设及到的一株产乙基长春胺夹竹桃科内生真菌的培养及其代谢产物的 应用方法，用下列实施例说明，但本发明的保护范围不局限于此。 阳02引实施例1 :菌株的分离
[0026] (1)预处理：用自来水反复冲洗样品3-4遍，去掉灰尘与泥上，剪掉质量差或有病 害情况的植物组织，而后蒸馈水漂洗，取新鲜的夹竹桃植物的皮质部，用1 %的盐酸溶液浸 泡化-3h，用蒸馈水反复冲洗，用75 %的乙醇浸泡lOmin，接着用无菌水漂洗3次，用滤纸吸 走水分，阴干备用。
[0027] (2)预处理效果检测：无菌水检验：将（1)步骤最后一步的洗涂液，在无菌的环境 下，抽出1ml左右悬液均匀涂布于制备好的固体培养基表面，放在洁净工作台27°C下培养， 观察生长情况。组织块印迹检验：将样本在表面消毒后，找相对植物组织，放在制备好的固 体培养基表面，放在洁净工作台27±2°C培养，观察生长情况。
[0028] (3)分离操作：将经过预处理的植物组织在无菌条件下切成Icmxlcm小块，转接在 制备好的分离培养基上，于27°C倒置培养至菌丝覆盖培养皿，待组织块周围长出菌丝后挑 取尖端部分，继续接种培养。
[0029] (4)菌种的纯化：取（3)步骤挑选的菌种，采用平板划线法接种到纯化培养基上， 划线完毕后倒置在27°C溫度下的恒溫培养箱中培养3天。多次采用平板划线法纯化分离至 平板上新长出的菌落外部形态一致，得到菌种。
[0030] 菌种在平板培养基形态见附图1. 阳〇3U 实施例2:发酵培养
[0032] (1)菌株活化：取实验室中超低溫-80°C冻存的菌种，解冻后将其接种于已灭菌 的固体培养基上，轻摇使其均匀平铺于固体培养基，接种后在28°C恒溫培养箱中发酵培养 3d，进行菌种活化和放大培养，培养过程中记录菌丝形态，用显微镜观察菌丝和抱子特征
[0033] (2)种子培养基的制备：取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液 体种子培养基中，种子培养基的组成为：上豆：1〇%、葡萄糖：1%、薦糖1%、M拆O4I%。，牛肉 膏1 %，色氨酸1%。。27 °C下摇床培养3天，得种子发酵液；
[0034] (3)发酵培养：无菌条件下，按照10%的接种量接种于灭菌处理过的液体培养基 中，种子培养基的组成为：上豆：1〇%、葡萄糖：1%、薦糖1%、M拆O4I%。，牛肉膏1%，色氨酸 1%0〇
[0035] 27°C下间歇性震荡培养7天；
[0036] 菌种在液体培养基形态见附图2
[0037] 菌种微观形态见附图3 阳03引实施例3 :产物提纯
[0039] 发酵完毕，超声处理45min
[0040] (1)胞外产物提取：取已培养好的菌丝培养液，60°C下真空浓缩至100ml，用相同 体积的=氯甲烧萃取2次，萃取液45°C下真空浓缩至1ml。
[0041] (2)胞内产物提取：取培养完全的菌丝，烘干，粉碎后加入20mLS氯甲烧，浸泡12 小时，滤纸过滤，滤液45°C下真空浓缩至1ml。与（1)浓缩的液体合并，静置2地，有晶体析 出。
[0042] (3)产物含量的测定：采用HPLC、LC-MS等仪器测定产物。检测结果见图4、图5。
【主权项】
1. 一株产乙基长春胺夹竹桃科内生真菌，其特征在于：包括如下步骤： (1) 菌种分离与活化：取新鲜的夹竹桃植物的皮质部：将经过预处理的植物组织在无 菌条件下切成Icmxlcm小块，转接在制备好的分离培养基上，于27°C倒置培养至菌丝覆盖 培养皿，待组织块周围长出菌丝后挑取尖端部分，继续接种培养。取实验室保存的夹竹桃 科内生真菌菌种，在洁净工作台处操作，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体培养 基，于27±2°C倒置培养至菌丝覆盖培养皿；培养基组成成分为；土豆：10~20%、葡萄糖： 1%~5%、蔗糖1%~5%、1%3041%。~5%。，牛肉膏1%~5%，氨基酸1%。~5%〇。 (2) 发酵培养：取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体种子培养基 中，27±2°C下摇床培养，得种子发酵液；无菌条件下，按照10%的接种量接种于灭菌处理 过的液体培养基中，27 ±2 °C下间歇性震荡培养6~8天； (3) 产物处理：发酵完毕，超声处理30~45min;过滤，菌液减压蒸干至100~150ml， 有机溶剂萃取，菌丝干燥后粉碎，有机溶剂萃取，合并有机相，减压浓缩可得乙基长春胺、长 春新碱等长春胺类化合物。2. -种根据权利要求1所述的方法制备的夹竹桃科内生真菌。3. 根据权利要求2所述的内生真菌，其特征在于：生长较缓慢，呈辐射状，表面疏松、平 坦；菌落颜色初为白色，后颜色逐渐变深最终为紫黑色，正反面颜色不同，有气生菌丝；霉 味。4. 根据权利要求3所述的内生真菌的次级代谢产物，其特征在于；产乙基长春胺及长 春胺类化合物。
【专利摘要】本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株产乙基长春胺夹竹桃科内生真菌及其代谢产物的应用。该内生真菌的培养及其代谢产物的提取方法主要包括如下步骤：取新鲜的夹竹桃根茎，培养发酵，进行菌株的分离，挑取少量菌丝液体发酵培养得到次级代谢产物，过滤，萃取，可得到乙基长春胺等长春胺类化合物。本发明从夹竹桃树皮中分离筛选出一株产乙基长春胺内生真菌CH1，这为产乙基长春胺提供了一种新的研究思路；提供了利用内生真菌发酵获得定向活性代谢产物的方法；为生产长春胺类生物碱开发增添了新的途径，有利于实现自动化，工业化生产。CCTCC M201467620141229
【IPC分类】C12R1/645, C07D461/00, C12P17/18
【公开号】CN105200091
【申请号】CN201510096233
【发明人】刘佳佳, 彭樱子, 洪娟, 殷珍珍, 刘雄, 任娜
【申请人】中南大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年3月5日