一种纳米细菌16sRNA基因的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，尤其设及一种纳米细菌16SRNA基因的鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 根据国际前列腺炎合作网1998年提出的前列腺炎分类方法，前列腺炎共分为四 型。I型：急性细菌性前列腺炎，指前列腺急性细菌感染；II型：慢性细菌性前列腺炎，指前 列腺慢性复发性细菌感染；III型：慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合症（CP/CPPS)，其定义 为病史在3个月W上，骨盆区疼痛或不适，不同程度的排尿或性交时不适，此型根据前列腺 按摩液、精液中白细胞计数又分为炎症性和非炎症性两种亚型；IV型无临床炎症性前列腺 炎，没有症状，只是在病理检查或检查其他症状时发现前列腺按摩液中存在白细胞才偶然 被诊断。其中I型、II型患者数量少，IV型前列腺炎因无任何症状，勿须处理，亦无重要临床 意义。只有III型前列腺炎患者因常规检查及培养未能发现明确的病原体，病因不明，发病机 制不清，不能进行针对性治疗，临床疗效差，而且患者数量占临床慢性前列腺炎患者的60% 社。
[0003] 研究发现纳米细菌能分泌巧化脂多糖生物膜，具有较强的毒性。人体内感染的纳 米细菌，主要经泌尿系统排出体外。排尿时尿道高压可引起尿液返流进入前列腺导管和腺 胞内，在此过程中，尿液中的纳米细菌容易被伴随转移，进入到前列腺内，运可能在纳米细 菌感染前列腺过程中发挥主要和积极的作用。此外，前列腺导管细长、弯曲、开口处口径小， 与尿道成直角或斜行向上进入尿道，也有利于尿道病原体进入腺体，不利于腺体炎性渗出 物排除和引流，病原体可长期寄生在其中。W上诸多因素为纳米细菌在前列腺内感染和致 病提供了条件和可能。
[0004] 关于纳米细菌与III型前列腺炎和前列腺结石可能存在的病因学关系，目前国内外 只有少数学者在临床方面进行了探索。Jones等最初研究结果显示，前列腺炎患者血清中 纳米细菌抗原经过化ISA分析检出率显著高于正常男性及前列腺增生患者。Shoke等通过 对顽固性III型前列腺炎伴结石患者用四环素抗纳米细菌治疗后，发现患者临床症状显著改 善，结石变小或消失；还有人分别从III型前列腺炎患者的EPS及前列腺结石中分离、培养出 纳米细菌细菌，并发现其中纳米细菌具有较高感染率，分别达62. 5%、65%。在针对性治疗 后，EPS中纳米细菌阳性率明显下降。因此推断纳米细菌与III型前列腺炎和前列腺结石之 间存在着较密切关系，考虑为其重要病因。
【发明内容】
[0005] 本发明实施例的目的在于提供一种纳米细菌16SRNA基因的鉴定方法，旨在探索 III型前列腺炎及结石的病因和发病机制，解除患者痛苦，减少病患和社会医疗机构的资金 支出，节约更多的医疗资源。
[0006] 本发明是运样实现的，一种纳米细菌16SRNA基因的鉴定方法包括：
[0007]步骤一、根据纳米细菌 16sRNA基因序列（GeneBankaccessionnumber:X98419) 设ir|对弓I物女曰下；5，_aac邑aac邑act邑邑邑邑c邑邑ca邑邑c_3，；5,一cacccca邑tc邑ct邑accc_3，进行 引物合成，Primer Name :A，Lot No :AW09639，TM :66. 00 ;Primer Name :B，Lot No :AW09640， TM :64. 13 ;
[000引步骤二、提取纳米细菌全基因组DM,具体包括：
[0009] (1)制备菌液，用于提取纳米细菌全基因组DNA的菌液可W有S种不同的来源：① 从III型前列腺炎患者EPS中获得；②从前列腺结石中获得；③从标本的培养液中获得；
[0010] (2)按TIANDZ公司细菌DNA0UT使用手册VI. 3进行操作；
[0011] 步骤立、用合成的引物进行PCR扩增；
[0012] 步骤四、按TIANDZ公司柱式DNABACK使用手册V2. 2进行操作，回收特异性扩增片 段；
[0013] 步骤五、按TaKaRa PMD18-T Vector使用手册D101A进行操作，扩增片段克隆到 PMD-18T；
[0014] 步骤六、转化的质粒进行核巧酸测序，将测序结果与纳米细菌16SRNA序列进行比 较，鉴定新分离的纳米细菌。
[0015] 进一步，=种不同来源的菌液的制备方法分别为：
[0016] (1)取Im化PS，用生理盐水稀释5倍，经0. 45um滤器过滤，4°C离屯、40min(20， 000Xg)，弃上清，留取管底1ml充分混匀，再用无菌生理盐水稀释5倍，经0. 22um滤器过 滤，4°C离屯、40min(20,000Xg)，弃上清，留取管底沉淀，加入1当量盐酸0. 5mr混匀，37°C放 置30min;加入1MTris0. 5ml中和，22000g离屯、40min，留沉淀备用；
[0017] 似手术中无菌采取患者的结石标本，在1N肥1中浸泡30min，W去除矿物质，加 入0. 5MTriS进行中和，娠碎结石，用生理盐水配成5 %浓度，用0. 22ym滤膜过滤，4°C离屯、 40min(20000Xg)，留沉淀备用；
[0018] (3)标本培养4周后，培养管底部出现白色菌群沉淀，将培养管中的培养基大部分 弃去，留取管底部分lOOul，彻底混匀后，移入离屯、管中，加入适量生理盐水，22000g离屯、 40min;去上清，沉淀中加入1当量盐酸0. 5ml混匀，37°C放置30min;加入1MTris0. 5ml 中和，22000g离屯、40min，留沉淀备用。
[0019] 进一步，按TIANDZ公司细菌DNA0UT使用手册VI. 3进行操作，具体方法为：
[0020] (1)如果试剂盒内的溶液A和溶液B产生沉淀，需要65°C预热沉淀溶解，摇匀待 用；
[002。 似将0. 1-1. 5血过夜培养的菌液转移到1. 5血塑料离屯、管中，室溫 12000-15000g离屯、1分钟沉淀细菌，弃上清；
[00过 做加入600yL溶液A到细菌沉淀中，吹打均匀；
[002引 （4)加入150yL溶液B到离屯、管中，颠倒数次混匀后溶液中将有白色丝状悬浮物 产生，溶液B比较粘稠，可W在天平上称取150-160mg，也可W将ImL枪头剪去一截再吸取；[0024] (5)室溫放置3-5分钟。如果放置在65°C，可W提高DNA产量10-20%;
[00巧](6)加入200iiL自备氯仿，震荡混匀10-30秒，溶液将呈乳白色；
[002引 （7) 12000-15000g室溫离屯、2分钟，上清透明，中间层有白膜，小屯、转移上清到新 的1. 5mL塑料离屯、管中，避免触及中间层的白膜；
[0027] (8)在约750yL上清液中加入1倍体积的异丙醇，用手上下颠倒30秒混匀，此时 一般将有絮状DM沉淀出现，室溫下12000-15000g离屯、3分钟，弃上清，管底将有微小DM沉淀；
[002引（9)沉淀用1血75%乙醇清洗2次后，短暂离心吸弃残留的液体约50yL，立即加 入50-100yL自备的TE缓冲液溶解DNA沉淀；
[0029] (10)如果在第4步没有加RNaseA，或加后还有残留的RNA污染，可化扣入5-15iiL RNaseA溶液，37°C保溫30分钟，直接取5-10yL电泳检测DNA，如果需要测0D，则必须将降 解的RNA通过乙醇沉淀去除；
[0030] 进一步，用合成的引物进行PCR扩增，具体包括：
[0031] (l)PCR反应体系：
[0032] TaKaRa EX Tag(5U/ul) 化25川 10XEX Tag Buffer(Mg2 + Free) Mgcl2(25mM) 4jal :御TP Mixture(各2.5mM ). 4|il
[0033] 摸板DNA 2.5ng 引物l(20uM) i|il 引物2口OuM) 1片1 ddH20 up1:050ji I
[0034] 似PCR反应条件：
[0035]
[0036] (3)结果检测：反应结束后取5y1反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测；
[0037] 进一步，步骤四所述的按TIANDZ公司柱式DNABACK使用手册V2. 2进行操作，回收 特异性扩增片段的具体方法为：
[003引 （1)切取含DNA片段的琼脂糖凝胶lOOmg左右，，放入1. 5血离屯、管中，用移液枪头 捣碎，按重量比为1 :3到1 :5的比例加入通用溶胶液；
[0039] (2)将离屯、管在手中摇晃约5分钟使胶完全溶化，其间可W振荡数次W促进琼脂 糖凝胶的溶化，如果所加通用溶胶液体积大于500y以可适当增加溶胶时间；
[0040] (3)将离屯、管中的溶液转移到高载量离屯、吸附柱中，套上液体收集管，静置3分 钟，12000-15000g离屯、1分钟并倒掉收集管中的液体，若一次加不完，可分两次加入并离 屯、；
[0041] (4)加入500yL通用洗柱液于离屯、柱中，12000-15000g离屯、1分钟，倒弃收集管 中的废液；
[004引妨重复第（4)步操作1次；
[004引（6) 12000-15000g离屯、1分钟W去除离屯、柱中的残留液体；
[0044] (7)将离屯、柱置于一新的干净的离屯、管中，加25-50yL50-65°C预热的P册.0的 TE溶液，静置3分钟，12000-15000g离屯、1分钟；
[0045] (8)离屯、管底部所得溶液即为纯化的DNA溶液，可立即用于后续实验或者放冰箱 长期保存。
[0046] 进一步，步骤