五所述的按TaKaRaPMD18-TVector使用手册D101A进行操作，扩增 片段克隆到PMD-18T的具体方法为：
[0047] (1)在微量离屯、管中配制下列DNA溶液，全量为5y1;
[0048]pMD18-TorpMD19-TVector1y1
[0049]Controllnse;rt 1U1
[0050]地2〇 3y1
[0051]似加入 5y1 (等量）的SolutionI;
[0052] (3) 16°C反应 30 分钟；
[005引（4)全量（10y1)加入至100y1JM109感受态细胞中冰中放置30分钟；
[0054] (5) 42 °C加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟；
[005引 （6)加入890y1S0C培养基，37 °C振荡培养60分钟；
[0056] (7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的心琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，计数白色、 蓝色菌落；
[0057] 做挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。
[005引本发明利用从标本中分离培养出纳米细菌的菌液，根据基因库中纳米细菌leSrRNA基因序列设计引物，扩增出特异性片段，经过胶回收、T载体克隆、基因测序和 比对，结果发现所获得的特异性片段与基因库中的纳米细菌的leSrRNA基因高度一致： Identities= 1387/1409(98%)，Gaps= 4/1409(0% )，证实了从培养液中提取出的特异 性片段即是纳米细菌的leSrRNA，也又一次证实纳米细菌是有生命的微生物。
【附图说明】
[0059] 图1是本发明实施例提供的纳米细菌16SRNA基因的鉴定方法流程图。
【具体实施方式】
[0060] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0061] 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0062] 如图1所示，本发明是运样实现的，一种纳米细菌16sRNA基因的鉴定方法包括：
[0063]S101、根据纳米细菌 16sRNA基因序列（GeneBankaccessionnumber:X98419)设 t\对弓I物女曰下：5, 一aac邑aac邑act邑邑邑邑c邑邑ca邑邑c-3, ；5, 一cacccca邑tc邑ct邑accc-3,，进行弓| 物合成，PrimerName:A，LotNo:AW09639,TM:66. 00;PrimerName:B，LotNo:AW09640， TM:64. 13 ;
[0064]S102、提取纳米细菌全基因组DM,具体包括：
[0065] (1)制备菌液，用于提取纳米细菌全基因组DM的菌液可W有S种不同的来源：① 从III型前列腺炎患者EPS中获得；②从前列腺结石中获得；③从标本的培养液中获得；
[0066] (2)按TIANDZ公司细菌DNA0UT使用手册VI. 3进行操作；
[0067]S103、用合成的引物进行PCR扩增；
[0068]S104、按TIANDZ公司柱式DNABACK使用手册V2. 2进行操作，回收特异性扩增片 段；
[0069]S105、按TaKaRaPMD18-TVector使用手册D101A进行操作，扩增片段克隆到 PMD-18T；
[0070]S106、转化的质粒进行核巧酸测序，将测序结果与纳米细菌16SRNA序列进行比 较，鉴定新分离的纳米细菌。
[0071] 进一步，S102所述的S种不同来源的菌液的制备方法分别为：
[007引（1)取Im化PS，用生理盐水稀释5倍，经0. 45um滤器过滤，4°C离屯、40min(20， 000Xg)，弃上清，留取管底1ml充分混匀，再用无菌生理盐水稀释5倍，经0. 22um滤器过 滤，4°C离屯、40min(20,000Xg)，弃上清，留取管底沉淀，加入1当量盐酸0. 5mr混匀，37°C放 置30min;加入1MTris0. 5ml中和，22000g离屯、40min，留沉淀备用；
[007引 似手术中无菌采取患者的结石标本，在1N肥1中浸泡30min，W去除矿物质，加 入0. 5MTriS进行中和，娠碎结石，用生理盐水配成5 %浓度，用0. 22ym滤膜过滤，4°C离屯、 40min(20000Xg)，留沉淀备用。
[0074] 做标本培养4周后，培养管底部出现白色菌群沉淀，将培养管中的培养基大部分 弃去，留取管底部分lOOul，彻底混匀后，移入离屯、管中，加入适量生理盐水，22000g离屯、 40min;去上清，沉淀中加入1当量盐酸0. 5ml混匀，37°C放置30min;加入1MTris0. 5ml 中和，22000g离屯、40min，留沉淀备用。
[00巧]进一步，S102所述的按TIANDZ公司细菌DNA0UT使用手册VI. 3进行操作，具体方 法为：
[0076] (1)如果试剂盒内的溶液A和溶液B产生沉淀，需要65°C预热沉淀溶解，摇匀待 用；
[0077]似将0. 1-1. 5血过夜培养的菌液转移到1. 5血塑料离屯、管中，室溫 12000-15000g离屯、1分钟沉淀细菌，弃上清；
[007引 做加入600yL溶液A到细菌沉淀中，吹打均匀；
[0079] (4)加入150yL溶液B到离屯、管中，颠倒数次混匀后溶液中将有白色丝状悬浮物 产生，溶液B比较粘稠，可W在天平上称取150-160mg，也可W将1血枪头剪去一截再吸取；
[0080] (5)室溫放置3-5分钟。如果放置在65°C，可W提高DM产量10-20% ;
[0081] (6)加入200iiL自备氯仿，震荡混匀10-30秒，溶液将呈乳白色；
[008引 （7) 12000-15000g室溫离屯、2分钟，上清透明，中间层有白膜，小屯、转移上清到新 的1. 5mL塑料离屯、管中，避免触及中间层的白膜；
[0083] (8)在约750yL上清液中加入1倍体积的异丙醇，用手上下颠倒30秒混匀，此时 一般将有絮状DNA沉淀出现，室溫下12000-15000g离屯、3分钟，弃上清，管底将有微小DNA 沉淀；
[0084] (9)沉淀用1血75%乙醇清洗2次后，短暂离心吸弃残留的液体约50yL，立即加 入50-100yL自备的TE缓冲液溶解DNA沉淀；
[0085] (10)如果在第4步没有加RNaseA，或加后还有残留的RNA污染，可W加入5-15化 RNaseA溶液，37°C保溫30分钟，直接取5-10yL电泳检测DNA，如果需要测0D，则必须将降 解的RNA通过乙醇沉淀去除；
[0086] 进一步，S103所述的用合成的引物进行PCR扩增，具体包括：
[0087] (l)PCR反应体系：
[0088] TaKa民a E.X Tag(5U,/ul) 化25y] 1〇xEX Tag BuffeWMg2 + Free) 却1 Mgcl2(25mM) 4jil dNTP Mixoire(各2.5mM ) 4pl 麓献Dm 2 Sng 割#l(2QuM) lul 引物2(20uM) Ijil
[0089] ddH20 up1:050.u'l
[0090] 似PCR反应条件：
[0091]
[0092] (3)结果检测：反应结束后取5y1反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测；
[0093] 进一步，S104所述的按TIANDZ公司柱式DNABACK使用手册V2. 2进行操作，回收 特异性扩增片段的具体方法为：
[0094] (1)切取含DNA片段的琼脂糖凝胶lOOmg左右，尽可能多地把多余的胶切除，否则 会影响回收效率，放入1. 5mL离屯、管中，用移液枪头捣碎，按重量比为1 :3到1 :5的比例加 入通用溶胶液；
[0095] (2)将离屯、管在手中摇晃约5分钟使胶完全溶化，其间可W振荡数次W促进琼脂 糖凝胶的溶化，如果所加通用溶胶液体积大于500y以可适当增加溶胶时间；
[0096] (3)将离屯、管中的溶液转移到高载量离屯、吸附柱中，套上液体收集管，静置3分 钟，12000-15000g离屯、1分钟并倒掉收集管中的液体，若一次加不完，可分两次加入并离 屯、；
[0097] (4)加入500yL通用洗柱液于离屯、柱中，12000-15000g离屯、1分钟，倒弃收集管 中的废液；
[009引 妨重复第（4)步操作1次；
[0099] (6) 12000-15000g离屯、1分钟W去除离屯、柱中的残留液体；
[0100] (7)将离屯、柱置于一新的干净的离屯、管中，加25-50yL50-65°C预热的P册.0的 TE溶液，静置3分钟，12000-15000g离屯、1分钟；
[010。 （8)离屯、管底部所得溶液即为纯化的DNA溶液，可立即用于后续实验或者放冰箱 长期保存。
[0102] 进一步，S105所述的按TaKaRaPMD18-TVector使用手册D101A进行操作，扩增 片段克隆到PMD-18T的具体方法为：
[010引 （1)在微量离屯、管中配制下列DNA溶液，全量为5y1 ;
[0104]pMD18-TorpMD19-TVector 1y1
[0105]Controllnse;rt 1y1
[010引 地20 3y1
[0107]似加入 5y1 (等量