一种石油烃类降解菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及的是一种从采油废水生化处理池采集的活性污泥中自行富集分离得 到的高效降解石油控类的菌株。本发明还设及一种降解石油控类菌株的应用。
【背景技术】
[0002] 石油的主要成分是各种烧控、环烧控、芳香控的混合物，可溶于多种有机溶剂，不 溶于水。石油主要被用作燃油和汽油，也是许多化学工业产品如溶剂、化肥、杀虫剂和塑料 等的原料。石油组分中的多种多环芳控具有强烈的致"作用，其挥发性组分能引起人体 的脏器病变。伴随着我国经济的快速发展和对能源需求的增加，石油的需求量日益增大。在 石油及石油制品的生产运输和使用过程中，不可避免的产生泄露和排放，对生态环境产生 严重污染并危害人类健康。
[0003] 目前全球石油产量的80%来自内陆油田，我国勘探和开发的油田共有400多个， 覆盖地区面积达32万平方千米。石油开采和运输过程中不可避免的产生污染，±壤被石油 污染后会改变±壤的碳氮比和碳憐比，影响作物对营养成分的吸收；堵塞±壤空隙使透水 性、透气性降低，引起根系糜烂；引起±壤微生物群落发生变化，破坏±壤微生态环境，使± 壤生产力降低。治理石油控污染±壤主要有物理、化学和生物=种方法。物理法焚烧破坏 ±壤结构且造价昂贵，难W实施；化学浸出法所使用的化学试剂容易造成二次污染，限制了 化学法的应用。上世纪80年代W来生物修复石油污染±壤引起人们的关注，生物修复是指 利用微生物及其它生物将±壤中的石油降解成二氧化碳和水或其它无害物质，从而彻底修 复被污染±壤，是最具前景的±壤修复方法，其中筛选和分离高效石油降解菌是生物修复 技术的必然要求。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种具有良好的石油降解效果且对盐度有较强的适应能 力的石油控类降解菌。本发明的目的还在于提供一种石油控类降解菌的应用。 阳0化]本发明的石油控类降解菌命名为不动杆菌株AcinetobacterSP.B11，保藏在"中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、"，保藏日期为2015年1月6日，登记编号为 CGMCCNo.10283。保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号
[0006] 本发明的Acinetobactersp.Bll菌株在28°C生长良好，单菌落呈圆形，直径1~ 2mm，表面光滑、湿润，中央稍隆起，边缘整齐，呈牙黄色（附图1)。将菌株进行革兰氏染色， 观察发现菌株可被番红复染，为革兰氏阴性。菌株呈短杆状，两端纯圆，一般呈单个或成对， 不产生芽抱（附图2)。
[0007] 本发明的Acinetobacter sp. Bll菌株过氧化氨酶阳性、氧化酶阴性，不需要生长 因子，吗I噪实验不显色，不能使明胶液化，甲基红试验阴性。不能利用D-葡萄糖、D-木糖、 k阿拉伯糖、D-核糖，能利用巧樣酸钢作为唯一的碳源，并能利用硝酸钟和硫酸锭作为唯 一氮源（表1)。
[0008] 本发明的Acinetobactersp.Bll菌株16SrDNA测序表明其基因序列长度约 147化P，与其相似菌株均为不动杆菌，且最高相似度超过99%。
[0009] 本发明的菌株Bll生理生化特征列如下表：
[0011] 注："+"表示可W正常生长，"一"表示不能正常生长。
[0012] 本发明降解石油控类的Acinetobactersp.Bll菌株用于含油污水处理。
[0013] 本发明所提供的高效降解石油控类的Acinetobactersp.Bll菌株可用于含油污 水处理，具体条件如下：
[0014] 1、培养基配制
[0015] (1)菌种保藏及活化培养基（固体）：牛肉膏5.OgA,蛋白腺10.Og/l，^Cl5.Og/ L，琼脂20g/L，调节抑为7. 2~7. 4;
[0016] 似种子液培养基（液体，1L):牛肉膏5.Og/L，蛋白腺10.Og/L，化Cl5.Og/L，调 节抑为7. 2~7. 4;
[0017] 做降解培养基（液体，0. 05L):畑4側32.Og/L，K2HPO4I. 5g/L，KH2PO43.Og/L， M拆04 ? 7&0 0.Ig/L，无水CaClzO.Olg/L，胞2邸TA? 2&0 0.Olg/L，调节抑为 7. 2 ~7. 4， 一定量的石油。
[0018] W上培养基均在12rc灭菌20~30min。
[0019] 2、菌种活化
[0020] 取保存于4°C的菌种保藏培养基斜面的菌落涂布于活化培养基平板，30°C培养 24 ~36h。
[0021] 3、液体种子制备
[0022] 在活化培养基平板上挑取单菌落接种到种子液培养基，3(TC、200r/min摇床培养 12h。ODe。。波长下测定菌悬液浓度并将菌悬液稀释到0.8,作为种子液待用。
[0023] 4、石油控降解
[0024] 用灭菌后的移液枪取5mL种子液接入装有50mL降解培养基的150mL锥形瓶中，放 置于恒溫摇床中，lOOr/min，30°C培养7d。W未接菌培养基做空白，采用紫外分光光度法测 定培养基中剩余石油含量。
[0025] 本发明是从采油废水生化处理池采集的活性污泥中分离出的一株高效降解石油 控的菌株，命名为不动杆菌Acinetobactersp.B11。实验表明该菌能利用石油控作为唯一 碳源和能源生长繁殖，在纯培养条件下连续培养7天，该菌对lOOOmg/L的含油废水降解率 达到61. 5%。该菌株对盐度具有良好的适应能力，同时能够保持较高的石油控降解效果，当 含盐量为3. 0 %时，其7天石油降解率仍然可W达到50%。该菌良好的环境适应能力和出 色的石油控降解效果充分说明该菌可用于含油废水的生物处理及石油污染±壤的生物修 复等领域。
[00%] 本发明从采油废水生化处理池采集的活性污泥中富集分离得到的高效降解石油 控类的菌株，是一株有极高活力，对石油控具有良好降解效果的菌株，同时该菌株对矿化度 有良好的耐受能力，培养方法简单，可W直接用于石油污染治理，应用前景广阔。
【附图说明】
[0027]图1 :B11困株的困洛特化。 阳〇2引 图2 :B11菌株的革兰氏染色形态（X1000)。
[0029] 图3 :不同初始油浓度下菌株对石油的去除效果。
[0030] 图4 :不同盐度下菌株对石油的去除效果。
[0031] 图5:不同盐度对菌株生物量的影响。
【具体实施方式】
[0032] 下面举例对本发明做更详细的描述。
[0033] 实施例1:不同初试油浓度下菌株对石油控的降解效果
[0034] 1、取保存于4°C的菌种保藏培养基斜面的菌落涂布于活化培养基平板，30°C培养 24~3化后，挑取单菌落接种到种子液培养基中，30°C、200r/min摇床培养12h。ODe。。波长 下测定菌悬液浓度并将菌悬液稀释到0. 8,作为种子液待用。
[0035] 2、配制初始油浓度分别为100、200、500、1000、1500、2000、3000mg/L的降解培养 基。
[0036] 3、按照5 %的接种量将菌株种子液接种到不同石油浓度的降解培养基中，每个浓 度做=个平行样，不接种的培养基作为空白对照。
[0037] 4、置于30°C、l(K)r/min摇床培养7天后取样萃取，利用紫外分光光度计测定剩余 石油控的含量，考察菌种对不同初始油浓度含油废水的去除效果。当初始油浓度lOOOmg/L 时，菌种对石油的降解率最高，达到61. 5% (附图3)。相比中国专利CN101914470A公开的 不动杆菌7天27. 5%的石油降解率，降解效果明显提高。
[00測实施例2 :不同盐度下菌株对摇瓶中石油控的降解效果
[0039] 1、取保存于4°C的菌种保藏培养基斜面的菌落涂布于活化培养基平板，30°C培养 24~3化后，挑取单菌落接种到种子液培养基中，30°C、200r/min摇床培养12h。ODe。。波长 下测定菌悬液浓度并将菌悬液稀释到0. 8,作为种子液待用。
[0040] 2、配制盐浓度分别为0. 5%、1.0%、1.5%、2. 0%、2. 5%、3. 0%的降解培养基，油 浓度为200mg/L。
[0041] 3、按照5%的接种量将菌株种子液接种到不同盐度的降解培养基中，每个盐浓度 做=个平行样，不接种的培养基作为空白对照。
[0042] 4、置于30°C、100;r/min摇床培养7天，利用紫外分光光度计测定菌悬液浓度和剩 余石油控的含量。当含盐量为3. 0%时，其石油降解率达到50% (附图4)，生物量ODe。。值 为0. 8 (附图5)。
[0043] 本发明所提供的降解石油控的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中屯、，分类命名为Acinetobactersp.Bll。保藏编号为：CGMCCNo. 10283。
[0044] W上通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发 明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
【主权项】
1. 一种石油经类降解菌，其特征是命名为不动杆菌株Acinetobactersp.B11，保藏在 "中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"，保藏日期为2015年1月6日，登记编 号为CGMCCNo. 10283。2. 根据权利要求1所述的石油经类降解菌，其特征是Acinetobacter sp.Bll菌株在 28°C生长良好，单菌落呈圆形，直径1~2mm，表面光滑、湿润，中央稍隆起，边缘整齐，呈牙 黄色。3. 根据权利要求1或2所述的石油经类降解菌，其特征是Acinetobacter sp. Bll菌株 过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性，不需要生长因子，吲哚实验不显色，不能使明胶液化，甲基红 试验阴性。4. 根据权利要求1或2所述的石油经类降解菌，其特征是Acinetobactersp.Bll菌株 16SrDNA测序表明其基因序列长度约1470bp。5. 根据权利要求3所述的石油经类降解菌，其特征是Acinetobactersp.Bll菌株16S rDNA测序表明其基因序列长度约1470bp。6. -种权利要求1所述的石油经类降解菌的应用，其特征是Acinetobacter sp. Bll菌 株用于含油污水处理。7. 根据权利要求6所述的石油经类降解菌的应用，其特征是Acinetobacter sp. Bll菌 株用于初始油浓度为100~3000mg/L的含油污水处理。8. 根据权利要求6或7所述的石油经类降解菌的应用，其特征是Acinetobacter sp. Bll菌株用于盐浓度为0. 5%~3. 0%的含油污水处理。
【专利摘要】本发明涉及的是一种石油烃类降解菌及其应用。经鉴定这株菌为Acinetobacter？sp属，命名为Acinetobacter？sp.B11，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC？No.10283，将该菌株序列在Genbank中BLAST检索比对，发现该序列与Acinetobacter？sp菌株基因序列高度同源。该菌株在以石油烃为唯一碳源的培养基中生长良好，对石油烃具有良好的降解效果，同时对盐度具有良好的适应能力。由本发明技术方案生产的降解菌能高效降解环境中的石油烃，保护生态环境。CGMCC No. 1028320150106
【IPC分类】C02F101/32, C12R1/01, C12N1/20, C02F3/34
【公开号】CN105219674
【申请号】CN201510632607
【发明人】任芝军, 官涤, 张忠祥, 刘迁, 张志柳
【申请人】哈尔滨工程大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年9月29日