一种强分泌生产克氏原螯虾pmca蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高效分泌生产克氏原螯虾质膜Ca2+-ATPase (PMCA)蛋白的方法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]如何实现无/弱副作用的人工卵巢发育调控一直是经济虾蟹养殖的重要难题之一。目前人们虽已摸索出不少促虾蟹卵巢快速成熟方法，如控温、控光、强化营养条件、激素处理等，但眼柄切除仍是不少虾蟹人工育苗生产中促进亲虾卵巢快速成熟及产卵的最常用、最有效方法。目前在虾蟹繁殖季节，人工切除雌性虾蟹的单侧眼柄用以促进卵巢同步发育、快速成熟，提高抱卵量，已在不少国家较为普遍应用于多种海洋和淡水经济虾蟹(如斑节对虾、大西洋龙虾、锯缘青蟹等)的规模化养殖中。然而，应用实践中会出现无法避免的副作用:切除眼柄后易致亲体蜕皮周期缩短、死亡率上升、卵子质量下降等不良后果。眼柄切除诱导虾蟹类卵巢快速发育成熟(简称卵巢“眼柄切除效应”)存在相似的分子机制，深入阐明该分子机制将非常有助于发掘到新的、更合理的人工生殖调控分子靶点，从而指导发展可替代眼柄切除、无/弱副作用的人工卵巢促熟思路和方法，对于经济虾蟹类人工养殖业的发展具有重要价值。克氏原螯4下(Procambarus clarkii)，俗称龙4下、小龙4下，隶属节肢动物门、甲壳纲、十足目，是具较高经济价值的水产养殖品种之一，是研究虾蟹类卵巢“目艮柄切除效应”分子机制的一种非常好的代表动物。
[0003]PMCA蛋白在细胞内的主要作用是在Ca2+信号刺激后做精细的排Ca 2+扫尾工作，并长效地维持静息状态下胞内Ca2+浓度，受到CaM的正调控，是钙信号通路(calciumsignaling pathway)的重要调控分子。我们前期的研究表明calcium signaling pathway在克氏原螯虾“眼柄切除效应”的卵巢发育早期很可能发挥重要调控作用。深入研究克氏原螯4下calcium signaling pathway在“眼柄切除效应”诱导卵巢快速发育成熟中的作用和调控机制，首先需要获得大量高活性的PMCA蛋白，并用以制备PMCA蛋白单/多克隆抗体。因此我们采用生物安全级的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重组表达系统，构建高效分泌表达克氏原螯虾PMCA蛋白的基因工程菌，同时建立高产量发酵方法，为后续深入研究克氏原螯虾卵巢“眼柄切除效应”的分子机制奠定重要基础。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种高效分泌表达克氏原螯虾PMCA蛋白的基因工程菌，是将克氏原螯虾PMCA基因以pMA0911为表达载体，以枯草芽孢杆菌为宿主构建得到的基因工程菌，所述枯草芽孢杆菌是B.subtilis WB400、WB600或WB800中的一种。
[0005]在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是B.subtilis WB600。
[0006]本发明的第二个目的在于提供上述基因工程菌的构建方法，成功分泌表达了克氏原螯虾PMCA蛋白，主要包括以下步骤:(I)PCR扩增或化学合成PMCA基因序列，(2)将PMCA基因与表达质粒pMA09ll(wapA)连接，构建重组质粒pMA0911_PMCA ; (3)随后将pMA0911-PMCA转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB600，筛选验证获得阳性转化子。
[0007]在本发明的一种实施方式中，表达质粒pMA0911自身信号肽替换为wapA信号肽。
[0008]本发明的第三个目的在于提供应用上述基因工程菌分泌生产PMCA蛋白的方法，主要包括以下步骤:将重组菌用种子培养基活化后，以5-8%接种量菌液转入装液量50% -60%的发酵罐中，通气量0.8-1.0vvm，搅拌转速300_400r/min，pH不作控制，37 °C培养；发酵培养基成分为玉米淀粉22-32g/L，蛋白胨12-16g/L，酵母抽提物8_12g/L，硫酸铜
0.10-0.15mM0
[0009]在本发明的一种实施方式中，将重组菌用种子培养基活化后，以7%接种量菌液转入装液量1.6L的3L发酵罐中，通气量1.2vvm，搅拌转速400r/min，pH不作控制，37°C培养；发酵培养基成分为玉米淀粉26g/L，蛋白胨14g/L，酵母抽提物10g/L，硫酸铜0.13mM。
[0010]本发明还提供一种高效分泌表达克氏原螯虾PMCA蛋白的方法，以重组表达了克氏原螯虾PMCA基因的枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产克氏原螯虾PMCA蛋白。
[0011]在本发明的一种实施方式中，将PMCA基因与表达质粒PMA09Il(WapA)连接，构建重组质粒pMA0911-PMCA，然后转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB600，获得重组菌；发酵培养基成分为玉米淀粉22-32g/L，蛋白胨12-16g/L，酵母抽提物8-12g/L，硫酸铜0.10-0.15mM ;于37 °C通风发酵。
[0012]本发明相比现有技术的有益效果:本发明首次以枯草芽孢杆菌为表达宿主，实现了克氏原螯虾PMCA蛋白的高效分泌表达，重组PMCA蛋白的表达量约占上清液总蛋白量的60%，产量约1.06mg/mL,目前国际上无任何有关重组表达克氏原螯虾PMCA蛋白的报道。
【具体实施方式】
[0013]在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0014]下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0015]在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0016]实施例1重组质粒pMA0911-PMCA的构建。
[0017]克氏原螯虾PMCA基因的序列(GenBank登录号:AY455931)，设计引物PMCA-1:(5' -TCAGGAGTCGACATGGGCGACGATGCCAATAGTTC-3')和 PMCA-2: (5' -ACTGAGAAGCTTTCACAGAGCGAGTGGCATCCCTGAG-3')，利用PCR将PMCA基因的DNA编码框5 ’和3 ’两侧分别弓丨入Sal I和Hind I II限制性酶切位点(下划线表示)；通过双酶切、分子连接等基因操作将PMCA基因插入到表达质粒pMA0911 (wapA)，构建重组质粒pMA0911_PMCA。
[0018]实施例2SDS-PAGE分析B.subtilis WB600基因工程菌分泌表达的克氏原螯虾PMCA蛋白。
[0019]在卡那霉素浓度为50yg/mL的LB培养基中接种基因菌单克隆，37°C、100r/min培养过夜。随后将100 μ L过夜培养的菌液接种于10mL (含50 μ g/mL卡那霉素与0.13mM硫酸铜)的发酵培养基中，37°C、200r/min摇床培养24h，随后取出发酵液，8000r/min离心1min得到上清液，即为粗酶液。进一步利用离子交换层析法对粗酶液进行分离纯化。取粗酶液和纯化后的酶液进行12 %的SDS-PAGE蛋白电泳。上述相关方法均采用常规操作步骤。
[0020]实施例3发酵培养基条件的优化。
[0021]对发酵培养基中的玉米淀粉、蛋白胨及酵母抽提物浓度进行优化实验，并对发酵最佳温度进行研究，玉米淀粉浓度为26g/L时PMCA蛋白产量最高，达到0.755mg/mL ;蛋白胨浓度为14g/L、酵母抽提物浓度为10g/L、发酵温度37°C时，CaM蛋白产量可进一步提高到
0.910mg/mL 左右。
[0022]实施例4利用摸索出的最优发酵条件进行3L发酵罐规模的克氏原螯虾PMCA蛋白发酵生产。
[0023]重组菌用种子培养基活化后，菌液转入(7%接种量)3L发酵罐，装液量1.6L，发酵培养基成分为玉米淀粉26g/L，蛋白胨14g/L，酵母抽提物10g/L，硫酸铜0.13mM。通气量
1.2vvm,搅拌转速400r/min，pH不作控制，37°C培养40h后发酵结束，此时发酵液中克氏原螯虾PMCA蛋白产量最高，约1.06mg/mL。SDS-PAGE分析发酵上清液总蛋白显示明显特异表达条带，条带分子量与预期大小分子量?131.0kD—致。在此条件下，重组克氏原螯虾PMCA蛋白的表达量约占上清液总蛋白量的60 %，全为可溶性活性状态。
[0024]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1.一种高效分泌生产克氏原螯虾质膜Ca 2+-ATPase (PMCA)蛋白的基因工程菌，其特征在于，是将克氏原螯虾PMCA基因以pMA0911为表达载体，以枯草芽孢杆菌为宿主构建得到的基因工程菌，所述枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌WB400、WB600或WB800中的一种。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述PMCA基因的序列为GenBank登录号:AY455931。3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌是B.subtilisffB600o4.一种构建权利要求1-3任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，主要包括以下步骤:(I)PCR扩增或化学合成PMCA基因序列；(2)将PMCA基因与表达质粒pMA0911连接，构建重组质粒pMA0911-PMCA ； (3)将重组质粒pMA0911-PMCA转化枯草芽孢杆菌，筛选验证获得阳性转化子。5.权利要求1-3任一所述基因工程菌在分泌生产PMCA蛋白中的应用方法。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，主要包括以下步骤:将重组菌用种子培养基活化后，以5-8%接种量菌液转入装液量50% -60%的发酵罐中，通气量0.8-1.0vvm，搅拌转速300-400r/min，pH不作控制，37°C培养；发酵培养基成分为玉米淀粉22_32g/L，蛋白胨 12-16g/L，酵母抽提物 8-12g/L，硫酸铜 0.10-0.15mM。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将重组菌用种子培养基活化后，以7%接种量菌液转入装液量1.6L的3L发酵罐中，通气量1.2vvm，搅拌转速400r/min，pH不作控制，37°C培养；发酵培养基成分为玉米淀粉26g/L，蛋白胨14g/L，酵母抽提物10g/L，硫酸铜0.13mM08.一种高效分泌表达生产克氏原螯虾PMCA蛋白的方法，其特征在于，以重组表达了克氏原螯虾PMCA基因的枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产PMCA蛋白。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将PMCA基因与表达质粒pMA0911连接，构建重组质粒pMA0911-PMCA，然后转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB600，获得重组菌；发酵培养基成分为玉米淀粉22-32g/L，蛋白胨12-16g/L，酵母抽提物8-12g/L，硫酸铜0.10-0.15mM，于37 °C通风发酵。
【专利摘要】本发明公开了一种高效分泌生产克氏原螯虾质膜Ca2+-ATPase(PMCA)蛋白的方法，属于生物工程技术领域。本发明以克氏原螯虾PMCA基因，构建分泌表达载体pMA0911-PMCA并转化枯草芽孢杆菌表达菌株WB600中，通过培养条件优化，实现了高效分泌表达生产。本发明利用基因工程方法高效制备出高活性重组克氏原螯虾PMCA蛋白，为后续针对克氏原螯虾卵巢“眼柄切除效应”分子机制的深入研究奠定了重要基础。
【IPC分类】C12N1/21, C12N9/14, C12N15/75, C12N15/55, C12R1/125
【公开号】CN105219690
【申请号】CN201510651855
【发明人】管政兵, 水燕, 廖祥儒, 蔡宇杰, 戴紫雯
【申请人】江南大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月10日