一种用于提高cik细胞增殖速率的提取物制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种一种用于提高CIK细胞增殖速率的提取物制备方法。
【背景技术】
[0002]CIK是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗⑶3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。
[0003]CIK细胞优点如下:1.CIK细胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞可大量增殖，且细胞活性也大大增强。2.CIK细胞具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用。3.杀瘤谱广，可用于白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肠癌等多种肿瘤的治疗，对多重耐药肿瘤细胞同样敏感。4.是典型的个性化生物治疗模式。将这类细胞回输后，还能使机体免疫能力提高，产生特异的抗病毒作用，从而对肿瘤治疗施以双重的作用。5.由于CIK细胞是活化的自体细胞，用起来非常安全。
[0004]肿瘤生物治疗是当今肿瘤研究领域的一大热点，肿瘤生物治疗包括细胞因子、基因治疗、单克隆抗体、肿瘤疫苗和过继性免疫治疗等方法，其中肿瘤细胞过继性免疫治疗在肿瘤生物治疗中占据着重要地位。细胞过继免疫治疗是目前研究较多并已进入临床试验的生物治疗方法。它是将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，杀灭患者体内的肿瘤细胞；适合细胞免疫功能低下的患者，如大剂量化疗、放疗后、骨髓移植后、病毒感染损伤免疫细胞数量及功能的患者。细胞因子诱导的杀伤细胞CIK的出现，为肿瘤过继性免疫治疗带来了新的希望。CIK细胞是由美国斯坦福大学的Schmidt Wolf等于1991年率先发现的，他们将人外周血单核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得了一群异质细胞，该细胞共同表达了 CD3和CD56两种膜蛋白分子，是目前所知杀伤活性最强的一种肿瘤生物治疗效应细胞，该细胞兼具T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤等优点。结合手术切除、介入、射频、氩氦刀等治疗，可清除不能用手术切除的极微小瘤灶或是体内散存的瘤细胞，在延缓或阻止肿瘤的转移或复发方面有重要作用；对于部分暂时不适宜做手术、介入或其它治疗的肿瘤患者，也可以先进行CIK细胞治疗，提高身体机能状况，改善生活质量，争取其它治疗机会。
[0005]传统的CIK细胞体外长期培养法米用静态和间歇换液的方式，传统培养方式为了获得足够数量的细胞，治疗一个病人往往需要处理上百个培养瓶或培养袋，易引起污染，影响细胞质量和稳定性，因此离产业化和临床要求甚远。因此，CIK细胞的体外大量增殖，SP如何进一步提高其体外增殖速率，是大规模使用CIK细胞免疫治疗的关键所在。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种能够大大提高CIK细胞增殖速率的提取物制备方法。
[0007]为了实现以上目的，本发明的技术方案如下:一种用于提高CIK细胞增殖速率的提取物制备方法，其特征在于:首先准备以下重量份的原料:黄芪8份，甘草10份，红参12份，红花15份、干姜20份，防风30份、制川乌3份，岩椒草13份、通草6份；然后按照以下步骤制备；
[0008]第一步，将以上原料加水煎煮；其中，加水量为原料重量的5-10倍，煎煮时间为3-4小时；然后过滤、浓缩收集提取液I ;
[0009]第二步，将提取液I用乙醇沉淀，然后过滤，回收乙醇，得提取液II ;
[0010]第三步，将精制提取液II经大孔吸附树脂，然后用蒸馏水洗脱至无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，再经0.45 μ m微孔滤膜滤过，滤液浓缩至5g生药/ml，调pH值，再经0.22 μ m微孔滤膜滤过除菌，最后分装即得中药提取物。
[0011]进一步，第二步，第三步中采用的乙醇的用量与提取液同体积。
[0012]进一步，第一步中加水量为原料重量的8倍。
[0013]与现有技术方案相比，本发明的有益效果:本发明所述的中药提取物与其他化学诱导增殖因子相比，对人体无毒副作用，故诱导增殖后的CIK细胞直接可以用于临床试验。
(2)本发明的中药提取物，具有明显提高CIK细胞增殖速率的作用，激活后的细胞杀伤疗效高于以前的无中药提取物CIK细胞治疗效果。
【具体实施方式】
[0014]下面对本发明作进一步说明。
[0015]实施例:首先准备以下重量份的原料:黄芪Sg，甘草10g，红参12g，红花15g、干姜20g，防风30g、制川乌3g，岩椒草13g、通草6g ;然后按照以下步骤制备；第一步，将以上原料加水煎煮；其中，加水量为1000g，煎煮时间为3.5小时；然后过滤、浓缩收集提取液I ;第二步，将提取液I用乙醇沉淀，然后过滤，回收乙醇，得提取液II ;第三步，将精制提取液II经大孔吸附树脂，然后用蒸馏水洗脱至无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，再经0.45 μ m微孔滤膜滤过，滤液浓缩至5g生药/ml，调pH值，再经0.22 μ m微孔滤膜滤过除菌，最后分装即得中药提取物。其中，采用的乙醇的用量与提取液同体积。
[0016]实验分两组，第一组是常规CIK细胞培养方法培养，第二组是往常规RPMI 1640完全培养液加入以上制备的提取物，加入量分别为3%，5%，7% (3%，5%，7%即为占培养液重量的百分比)。每组采用3个相同的培养器皿培养。
[0017]常规CIK细胞培养方法属于现有的公知技术，这里就不详细描述培养的方法，只是一笔带过。
[0018]第14天的扩增倍数检测结果显示，含3%、5%、7%中药提取物的培养基中细胞绝对数比无中药提取物高2.1、3、3.3倍。分别对3%、5%、7%中药提取物诱导增殖后的细胞进行肿瘤细胞的杀伤率的检测发现对肿瘤细胞的杀伤率均达到98%以上。
【主权项】
1.一种用于提高CIK细胞增殖速率的提取物制备方法，其特征在于:首先准备以下重量份的原料:黄芪8份，甘草10份，红参12份，红花15份、干姜20份，防风30份、制川乌3份，岩椒草13份、通草6份；然后按照以下步骤制备； 第一步，将以上原料加水煎煮；其中，加水量为原料重量的5-10倍，煎煮时间为3-4小时；然后过滤、浓缩收集提取液I ; 第二步，将提取液I用乙醇沉淀，然后过滤，回收乙醇，得提取液II ; 第三步，将精制提取液II经大孔吸附树脂，然后用蒸馏水洗脱至无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，再经0.45 μ m微孔滤膜滤过，滤液浓缩至5g生药/ml，调pH值，再经0.22 μ m微孔滤膜滤过除菌，最后分装即得中药提取物。2.根据权利要求1所述的用于提高CIK细胞增殖速率的提取物制备方法，其特征在于:第二步，第三步中采用的乙醇的用量与提取液同体积。3.根据权利要求1所述的用于提高CIK细胞增殖速率的提取物制备方法，其特征在于:第一步中加水量为原料重量的8倍。
【专利摘要】本发明公开了一种用于提高CIK细胞增殖速率的提取物制备方法，其特征在于：首先准备以下重量份的原料：黄芪8份,甘草10份，红参12份，红花15份、干姜20份，防风30份、制川乌3份，岩椒草13份、通草6份；然后按照以下步骤制备；第一步，将以上原料加水煎煮；其中，加水量为原料重量的5-10倍，煎煮时间为3-4小时；然后过滤、浓缩收集提取液I；第二步，将提取液I用乙醇沉淀，然后过滤，回收乙醇，得提取液II；第三步，将精制提取液II经大孔吸附树脂，然后用蒸馏水洗脱至无色，再用乙醇洗脱，收集洗脱液。本发明制备的提取物可以大大提高CIK细胞的增殖速率。
【IPC分类】A61K35/17, C12N5/0783, A61P35/00
【公开号】CN105255828
【申请号】CN201510733428
【发明人】秦岭
【申请人】江苏善之源健康科技有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月31日