一种从腺病毒中提取dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中一种从腺病毒中提取DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，在自然界分布广泛，至少存在100种W上的 血清型。其基因组长约36化，两端各有一个反向末端重复区aTR)，ITR内侧为病毒包装信 号。基因组上分布着4个早期转录元（E1、E2、E3、E4)承担调节功能，W及一个晚期转录元 负责结构蛋白的编码。早期基因E2产物是晚期基因表达的反式因子和复制必须因子，早期 基因E1A、E1B产物还为E2等早期基因表达所必须。因此，E1区的缺失可造成病毒在复制 阶段的流产。E3为复制非必须区，其缺失则可W大大地扩大插入容量。腺病毒载体大多W 5型（Ad5)、2型（Ad2)为基础，新增了 55型（Ad55)，很多研究机构在研究当中，55型将比5 型流行W及应用更具广泛性。
[0003] 腺病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100%的转导效率；可转导不同类 型的人组织细胞，不受祀细胞是否为分裂细胞所限；容易制得高滴度病毒载体，在细胞培养 物中重组病毒滴度可达lOXlOllvp/ml;进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间 表达，安全性高。因而，腺病毒载体在基因治疗临床试验方面有了越来越多的应用，成为继 逆转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种能快速从腺病毒中提取DNA，能满足下游分子生物学 实验的高质量的DNA的方法，整个实验过程快速便捷，提取的DNA质量高，实验结果重复性 好。
[0005] 本发明所提供的DNA的提取方法，包括W下步聚：
[000引 （1)材料；含病毒颗粒数为1. 0XlOVp/mlW上的病毒液；
[0007]似提取DNA
[000引裂解；加入200μ1细胞裂解液肿=7~8)，润旋混匀；加入50~100μ1 20mg/μ1蛋白酶K，5(TC温15分钟；
[0009] 抽提；加入200μ1氯仿，离必，取上清，然后加入1. 5~2. 5倍的异丙醇沉淀；
[0010] 样品的清洗和保存；70%己醇清洗2~3次，然后溶于灭菌水，在-8(TC保存；
[0011] (3)DNA质量的检测
[0012] 通过NanoDropND-1000分光光度计（美国Nano化op科技有限公司）和1 %凝胶 检测提取的DNA的纯度，得率和完整性。
[001引表1.提取DNA含量及纯度[0014]
[0015] 本发明通过加入细胞裂解液和蛋白酶Κ，使腺病毒的细胞壁得到了充分裂解，简化 了实验过程，节省了实验时间，同时也避免了长时间水浴，造成基因组DNA的断裂。
【具体实施方式】
[0016] 1、取500μ1腺病毒，加200μ1细胞裂解液，充分混匀，然后加入50~100μ1 20mg/ml蛋白酶Κ，振荡混匀，5(TC保温15分钟；
[0017] 细胞裂解液（PH= 7 ~8)的配方是；lOmMTris-HCl(PH= 7. 5)，lOmM邸TA(PH= 8.0),0.5% (g/v)SDS〇
[0018] 2、在1.5ml离必管中加入200μ1氯仿，充分混匀，4°C,12,000Xg，离必15分钟；
[0019] 3、取上清，加到一个新的EP管中，加入1ml异丙醇，充分混匀，-2(TC沉淀过夜；异 丙醇的加入量的最优体积是取上清的1. 5~2. 5倍。
[0020] 4、4°C，12,000X巧m，离必10分钟，去上清，加lml75%己醇；4°C，7,500Xg，离必 5分钟，去上清，真空干燥。溶于30μ1灭菌水，待用。
[0021] 5、加1μ1溶解有DNA的溶液到NanoDropND-1000分光光度计中，测定其纯度；然 后加入1μg左右的DNA，1 %琼脂糖电泳，60V，40分钟，检测其完整性。
[0022] 经Nano化op测定（表1)，本发明提取的DNA的A260nm/A280皿的值为2. 00左右， 得率每毫升菌能提取15μg左右DNA，送说明本发明提取的DNA的纯度是高。
[0023] 将本发明提取的DNA进行聚合酶链式（PCR)反应，祀基因是LMP2,在200μ1PCR管 中加入0. 4μ1DNA为模板进行PCR，反应条件是；95°C5分钟；95°C15砂，56°C31砂，72°C1 分钟，40个循环；72°C，10分钟。然后将PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳。
【主权项】
1. 一种从腺病毒中提取DNA的方法，其特征在于该方法包括如下步聚： ⑴材料：含病毒颗粒数为1.OXl〇8vp/ml以上的腺病毒液； (2)DNA提取 裂解：加入200μ1细胞裂解液，涡旋混匀；加入50~100μ1 20mg/μ1蛋白酶K，50°C温15分钟； 抽提：加入200μ1氯仿，离心，取上清，然后加入1. 5~2. 5倍的异丙醇沉淀过夜； 样品的清洗和保存：清洗后的DNA样品后加入灭菌水溶解，在-80°C保存。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：在步聚（2)中，加入的细胞裂解液PH= 7. 5， 用量是500μ1~lml/ml病毒液。3. 根据权利要求1所述的方法。其特征在于：在步聚2)中，加入的异丙醇的体积是上 清的2倍。
【专利摘要】本发明公开了一种快速从腺病毒中提取DNA方法，包括裂解、抽提、样品的清洗和保存、DNA质量的检测等步骤。根据所得数据和电泳结果，表明所得总RNA的纯度高、产率高、完整性好。本发明实验过程快速、简洁、重复性好。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105255856
【申请号】CN201410490318
【发明人】戴东升, 王星星, 杨仁佳, 焦进安, 陈婧, 周鹏, 王斐
【申请人】亚宝药业太原制药有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年9月24日