双酶法制备甜菊单糖苷的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然化合物的生物合成技术领域，具体设及利用常见的糖巧酶一步法 直接催化制备甜菊单糖巧的方法。
【背景技术】
[0002] 从甜叶菊叶子中提取的甜菊糖巧不仅是一类高甜度低热值的天然甜味剂，而且甜 菊糖巧还具有多种药理活性。新版甜菊糖巧国标（GB8270-2014)指出，甜菊糖巧包括甜菊 巧（Stevioside，Stv)、瑞鲍迪巧ACrebaudioside A，Reb A)、瑞鲍迪巧B(rebaudioside B， Reb B)、瑞鲍迪巧CCrebaudioside C，Reb C)、瑞鲍迪巧DCrebaudioside D，Reb D)、瑞鲍迪 巧F(rebaudioside F，Reb F)、杜克巧A(dulcoside A)、甜茶巧（rubusoside，Ru)、甜菊双 糖巧（stevio化ioside，訊io)等九种糖巧。运些糖巧可W直接应用，也可W进一步衍生化， 得到更多自然界中鲜有并且具有特殊功能性的糖巧。如对其中含量最高的甜菊巧Stv进 行糖基化可W提高溶解性，降低后苦涩味；又如本发明人已公开一种用来源于Sulfolobus sp.的β-葡萄糖巧酶催化制备甜菊醇的方法（专利号：201210352461. 6)，可W-步法得 到高纯度甜菊醇；再如酸性水解Stv得到异甜菊醇，然后对其进行修饰，可W得到具有特定 药理活性的衍生物。
[0003] 甜菊单糖巧（steviolmonoside，Sm，CAS:60129-60-4)是一种在自然界中鲜有的 甜菊糖巧，甜茶叶子（RubussuavissimusS.Lee)醇沉可W得到少量Sm化ohGarYee等， 2009)。水解Stv，RebA等过程中产生也会产生Sm，但会进一步水解生成甜菊醇或异甜菊 醇（deOliveiraBΗ等，2007)，因而控制反应停在甜菊单糖巧Sm运一步，需要较高的反应 选择性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种简便的方式制备高纯度甜菊单糖巧。本发明选用两种比 较常见的糖巧酶，一步法催化水解甜菊巧stv制备甜菊单糖巧，具体反应方程式如下： 阳0化]
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
[0007] 将甜菊糖巧配制成lOmg/mL到250mg/mL的水溶液，然后在37°C-45°c下恒溫揽拌 0. 5h，反应的抑值始终控制在7左右。按照顺序分别加入一定量两种糖巧酶，加入第二种 酶时反应升溫至55°C-75°C，总反应lh-24h;过滤，洗涂，重结晶即可得甜菊单糖巧。加入两 种糖巧酶的顺序为，先为来源于酵母的β-葡萄糖巧酶，然后再加入来源于黑曲霉的β-葡 萄糖巧酶，时间间隔为化-12h，加入的比例为1:5。
[0008] 本发明的有益效果：
[0009] 利用常见的糖巧酶催化甜菊巧stv制备甜菊单糖巧，本发明具有廉价，简单，高 效，产物纯度高，分离容易等优点。
【附图说明】
[0010] 图1甜菊单糖巧的离子流图（a:总离子流图；b:479. 3选择性离子流图） W11] 图2甜菊单糖巧的质谱图（479. 3, [M,m-田；965. 6,巧Μ,m-田；）
【具体实施方式】
[0012] 下面结合实施例对本发明进行详细说明，其目的仅在于更好的说明本发明的内容 但并不W任何方式限制本发明。 阳〇1引实施例1
[0014] 配制甜菊巧溶液50血，浓度为lOmg/mU然后在37°C下恒溫揽拌0.化，反应的抑 值始终控制在7左右。先按照800U/gStv加入来源于酵母的β-葡萄糖巧酶，反应化；再 加入来源于黑曲霉的β-葡萄糖巧酶2000U/gStv，加入第二种酶时反应升溫至55°C，再 反应12h;过滤后用纯水洗涂Ξ次，水/甲醇/异丙醇溶液中重结晶即可得高甜菊单糖巧。 册1(：分析5切的转化率为95.0%，5111的产率和纯度分别为85.4%和96.0%。 阳〇1引实施例2
[0016] 配制甜菊巧溶液50血，浓度为250mg/mU然后在45°C下恒溫揽拌0.化，反应的抑 值始终控制在7左右。先按照1500U/gStv加入来源于酵母的β-葡萄糖巧酶，反应12h; 再加入来源于黑曲霉的β-葡萄糖巧酶3000U/gStv，加入第二种酶时反应升溫至75°C， 再反应化；过滤后用纯水洗涂Ξ次，水/甲醇/异丙醇溶液中重结晶即可得高甜菊单糖巧。 HPLC分析Stv的转化率为90. 5%，Sm的产率和纯度分别为88. 5%和95. 0%。
[0017] 实施例3
[00化]用甜叶菊提取物配制甜菊巧溶液100血，stv含量为lOOmg/mU然后在40°C下恒溫 揽拌0.化，反应的抑值始终控制在7左右。先按照500U/gStv加入来源于酵母的β-葡 萄糖巧酶，反应1她；再加入来源于黑曲霉的β-葡萄糖巧酶1500U/gStv,加入第二种酶时 反应升溫至75°C，再反应化；过滤后用纯水洗涂Ξ次，水/甲醇/异丙醇溶液中重结晶即 可得高甜菊单糖巧。HPLC分析Stv的转化率为83. 5%，Sm的产率和纯度分别为75. 0%和 90. 8%。
[0019] 实施例4
[0020] 配制甜菊巧溶液化，浓度为250mg/mU然后在45°C下恒溫揽拌0.化，反应的抑值 始终控制在7左右。先按照3000U/gStv加入来源于酵母的β-葡萄糖巧酶，反应12h;再 加入来源于黑曲霉的β-葡萄糖巧酶3000U/gStv,加入第二种酶时反应升溫至75°C，再 反应12h;过滤后用纯水洗涂Ξ次，水/甲醇/异丙醇溶液中重结晶即可得高甜菊单糖巧。 HPLC分析Stv的转化率为98%，Sm的产率和纯度分别为92. 5%和96. 0%。
【主权项】
1. 一种制备甜菊单糖苷的方法，其特征在于将甜菊糖苷配制成lOmg/mL到250mg/mL 的水溶液，然后在37°C_75°C下恒温搅拌0. 5h，按照顺序分别加入一定量两种糖苷酶，反应 lh-24h;过滤，洗涤，重结晶即可得甜菊单糖苷。2. 根据权利要求1所述的一种制备甜菊单糖苷的方法，其特征是所述的甜菊糖苷为甜 菊苷或是含有甜菊苷的甜叶菊提取物。3. 根据权利要求1所述的一种制备甜菊单糖苷的方法，其特征是所述的加入两种糖苷 酶的顺序为，先为来源于酵母的β-葡萄糖苷酶，然后再加入来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷 酶，时间间隔为6h-12h，加入的比例为1:5。4. 根据权利要求1所述的一种制备甜菊单糖苷的方法，其特征是所述的温度为先保持 在37°C-45°C，然后加入第二种糖苷酶后再控制在55°C-75°C，反应的pH值始终控制在7 左右。
【专利摘要】本发明公开了一种制备甜菊单糖苷的方法。属于天然化合物的合成技术领域。以常见的糖苷酶为催化剂，一步法催化甜菊糖苷水解制备单糖苷。该种方法具有方法简单、选择性和转化率高、成本低廉、分离提纯简单等优点。本发明提供了一种高效、简便、廉价的新方法以制备甜菊单糖苷。
【IPC分类】C12P19/56
【公开号】CN105255971
【申请号】CN201510707477
【发明人】万会达, 李丹, 夏咏梅, 覃晓雨, 郝家军, 樊健, 谢杰灵, 田加腾
【申请人】江南大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月27日