一种利用issr分子标记检测花生种子纯度的方法
【技术领域】
[0001]—种利用ISSR分子标记检测花生种子纯度的方法属于花生种子纯度鉴定技术领域，具体地说是利用ISSR分子标记检测花生种子纯度技术领域。
【背景技术】
[0002]花生是我国重要的油料作物和经济作物，我国年均种植花生7000多万亩，年需要花生种子160万吨，花生用种量大，不同品种间种子差异性较小，单纯从植株和荚果等外部性状很难区分品种间的差异，导致我国花生种子市场混乱，种子纯度很低，很多种业公司甚至出现张冠李戴现象，一个品种的种子当成多个品种的种子来售卖。急需要一种方便快捷准确的花生种子纯度鉴定方法。
[0003]简单重复序列间扩增(ISSR)是一种在简单重复序(SSR)基础上发展起来的新型的分子标记。该技术以锚定的微卫星DNA为引物，在SSR序列的3’或5’端加锚2.4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片断进行PCR扩增。所扩增的Inter.SSR区域的多个条带可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨。它结合RAPD标记技术幂HSSR标记技术的优点，能够提供更多的基因组DNA信息。现己广泛应用于植物种质资源鉴定、进化与亲缘关系分析、遗传多样性与居群遗传结构检测、遗传作图、基因定位、分子标记辅助育种等方面的研究。ISSR标记技术试验操作简单、快速、高效，不需要繁琐的构建基因文库、杂交和同位素显示等步骤；重复序列和锚定碱基的选择是随机的，无需知道任何靶标序列的SSR背景信息，从而降低了技术难度和实验成本；无需活材料，无组织器官特异性，能实现全基因组无编码取样:采用了较长的引物(17。24bp)，退火温度较高，因此，引物具有更强的专一性，增强了实验可重复性。
【发明内容】
[0004]解决花生种子鉴定困难且不准确的难题，本发明利用ISSR分子标记鉴定花生纯度。
[0005]本发明通过以下技术方案来实现:
通过 4 条 ISSR 引物 WLS1:AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC ；WLS2:CAT GGT GTT GGT CATTGT TCC A ；WLS3:AGA GAG AGA GAG AGA GYC 和 WLS4:AGA GAG AGA GAG AGA GCL 来鉴别花生种子的纯度。鉴别种子纯度的ISSR-PCR反应的最优体系(20 μ 1)为1.4U Taq DNA聚合酶，0.35mmol/L dNTP，0.7 μ mol/L 引物，25ng 模板 DNA, 1.75mmol/L MgC12，lOxPCRBuffer 2.Ομ?，加ddH20至25μ1。鉴别种子纯度的ISSR-PCR反应条件为:在PCR仪中预变性94°C 120秒，然后循环:94°C 50秒，70°C 30秒，72°C 130秒，共38轮循环。循环结束后，72°C 15分钟，4°C保存。电泳结束后，取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于1.6%或1.8%琼脂糖胶上电泳，稳压50-100V(电压低带型整齐，分辨率高)；电泳结束，溴化乙锭染色20分钟，用凝胶成像仪观察、拍照，观察电泳条带数和位置来鉴别花生种子纯度。如果样品电泳条带数一样多而且位置相同，则表明是同一个品种。
[0006]本发明的有益效果是利用ISSR分子标记鉴定花生种子纯度，可以有效防止假杂种掺入，不仅可以使种子播后苗情一致，充分发挥良种的增产潜力，作物生长整齐，成熟期一致，有利于机械化作业。
【具体实施方式】
[0007]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为对
【发明内容】
的详细说明，并不用于限定本发明，任何本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下，对本发明专利内容的修改，都将等价落在本发明专利的保护范围内。
[0008]实施例1
随机抽取大花生新品种花育33号的种子样品100份，通过4条ISSR引物WLS1:AGA GTTGGT AGC TCT TGA TC ；WLS2:CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A ；WLS3:AGA GAG AGA GAG AGAGYC和WLS4:AGA GAG AGA GAG AGA GCL来鉴别种子的纯度。鉴别种子纯度的ISSR-PCR反应的最优体系(20 μ 1)为 1.4U Taq DNA 聚合酶，0.35mmol/L dNTP，0.7 μ mol/L 引物，25ng模板 DNA，1.75mmol/L MgC12，lOxPCR Buffer 2.0 μ 1，加 ddH20 至 25 μ 1。鉴别种子纯度的ISSR-PCR反应条件为:在PCR仪中预变性94°C 120秒，然后循环:94°C 50秒，70°C 30秒，72°C 130秒，共38轮循环。循环结束后，72°C 15分钟，4°C保存。电泳结束后，取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液^x)于1.6%琼脂糖胶上电泳，稳压50-100V(电压低带型整齐，分辨率高)；电泳结束，溴化乙锭染色20分钟，用凝胶成像仪观察、拍照，观察电泳条带数和位置来鉴别花生种子纯度。花育33号100份样品中，WLS1引物条带位置和数目完全相同，WLS2引物只有1个样品条带位置不同，WLS3引物1个样品条带数目不同，WLS4引物1个样品条带位置和数目不相同。检测结果表明花育33号花生新品种种子纯度在98%以上。
[0009]实施例2
随机抽取小花生新品种花育20号的种子样品100份，通过4条ISSR引物WLS1:AGA GTTGGT AGC TCT TGA TC ；WLS2:CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A ；WLS3:AGA GAG AGA GAG AGAGYC和WLS4:AGA GAG AGA GAG AGA GCL来鉴别种子的纯度。鉴别种子纯度的ISSR-PCR反应的最优体系(20 μ 1)为 1.4U Taq DNA 聚合酶，0.35mmol/L dNTP，0.7 μ mol/L 引物，25ng模板 DNA，1.75mmol/L MgC12，lOxPCR Buffer 2.0 μ 1，加 ddH20 至 25 μ 1。鉴别种子纯度的ISSR-PCR反应条件为:在PCR仪中预变性94°C 120秒，然后循环:94°C 50秒，70°C 30秒，72°C 130秒，共38轮循环。循环结束后，72°C 15分钟，4°C保存。电泳结束后，取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液^x)于1.8%琼脂糖胶上电泳，稳压50-100V(电压低带型整齐，分辨率高)；电泳结束，溴化乙锭染色20分钟，用凝胶成像仪观察、拍照，观察电泳条带数和位置来鉴别花生种子纯度。花育20号100份样品中，WLS1引物条带位置和数目完全相同的有96份，WLS2引物有5个样品条带位置不同，WLS3引物3个样品条带数目不同，WLS4引物3个样品条带位置和数目不相同。检测结果表明花育20号花生新品种种子纯度在95%以上。
【主权项】
1.一种利用ISSR分子标记检测花生种子纯度的方法，其特征在于它通过4条ISSR引物 WLSI:AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC ；WLS2:CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A ；WLS3:AGAGAG AGA GAG AGA GYC 和 WLS4:AGA GAG AGA GAG AGA GCL 来鉴别花生种子的纯度。2.鉴别种子纯度的ISSR-PCR反应的最优体系(20μ I)为1.4U Taq DNA聚合酶，0.35mmol/L dNTP，0.7 ymol/L 引物，25ng 模板 DNA, 1.75mmol/L MgCl2, 1xPCR Buffer2.0 μ 1，加 ddH20 至 25 μ L.3.鉴别种子纯度的ISSR-PCR反应条件为:在PCR仪中预变性94°C120秒，然后循环:94°C 50秒，70°C 30秒，72°C 130秒，共38轮循；循环结束后，72°C 15分钟，4°C保存。4.电泳鉴定，取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于1.6%或1.8%琼脂糖胶上电泳，稳压50-100V(电压低带型整齐，分辨率高)；电泳结束，溴化乙锭染色20分钟，用凝胶成像仪观察、拍照，观察电泳条带数和位置来鉴别花生种子纯度。
【专利摘要】本发明公开了一种利用ISSR分子标记检测花生种子纯度的方法，它通过4条ISSR引物WLS1：AGA？GTT？GGT？AGC？TCT？TGA？TC；WLS2：CAT？GGT？GTT？GGT？CAT？TGT？TCC？A；WLS3：AGA？GAG？AGA？GAG？AGA？GYC和WLS4：AGA？GAG？AGA？GAG？AGA？GCL来鉴别花生种子的纯度。鉴别种子纯度的ISSR-PCR反应的最优体系(20μl)为1.4U？Taq？DNA聚合酶，0.35mmol/L？dNTP，0.7μmol/L引物，25ng模板DNA，1.75mmol/L？MgCl2，10xPCR？Buffer？2.0μl，加ddH2O至25μl。利用ISSR分子标记技术可以快速鉴别花生种子的纯度，充分发挥花生新品种增产的潜力，增加种植户的积极性。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105256016
【申请号】CN201510646566
【发明人】郑辉, 王玉春, 黄翔
【申请人】山东卧龙种业有限责任公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月9日