早期诊断预测2型糖尿病的分子标志物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种糖尿病分子标志物及其应用，具体涉及一种早期诊断预测2型糖 尿病的分子标志物及其应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病已成为危害人类健康的重要原因，其发病受遗传和环境因素相互作用的影 响。2002年，Maier等提出糖尿病也是DNA甲基化的候选疾病之一，认为DNA甲基化在糖 尿病的发病过程中扮演重要的角色。近期研究表明，当糖尿病患者肌组织暴露于炎性环境、 游离脂肪酸或高血糖环境时，其PGC-Ia基因将会发生过度甲基化，研究者在糖尿病前期的 患者中也发现了类似现象，提示DNA修饰的变化可能是糖尿病的早期事件之一。因此，探索 DNA修饰的变化对于早期干预、控制病情具有一定的参考价值。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是，提供用于早期诊断预测2型糖尿病的分子标志物 及其应用。
[0004] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种早期诊断预测2型糖尿病的分子 标志物，为APN基因启动子区甲基化或TNF-α基因启动子区甲基化，其中，所述APN的序列 如SEQIDΝ0:1所示；所述TNF-α的序列如SEQIDΝ0:2所示。
[0005] 本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，早期诊断预测2型糖尿病的分 子标志物在制备早期诊断预测2型糖尿病试剂盒中的应用。
【附图说明】
[0006]图1为DHPLC对TNF-a基因甲基化检测，其中M:甲基化；U:非甲基化；F:肥胖；N:对照；T:糖尿病。
[0007] 图2为TNF-a基因DNA甲基化与mRNA相对拷贝数相关性。
[0008] 图3为DHPLC对APN基因甲基化检测，其中M:甲基化；U:非甲基化；F:肥胖；N: 对照；T:糖尿病。
[0009] 图4为APNDNA甲基化与mRNA相对拷贝数相关性。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
[0011] 实施例1 :TNF-α基因启动子区DNA甲基化抑制其mRNA表达
[0012] 1、试验方法
[0013] (1)指标检测：FPG采用葡萄糖氧化酶法检测，血脂采用全自动生化分析仪检测。
[0014] (2)DHPLC(Denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC) 技术检测TNF-α基因启动子区DNA甲基化：取新鲜脂肪组织200mg，抽提基因组DNA， 取样本基因组DNA1.8ug进行亚硫酸盐修饰。随后设计通用引物（不含CpG位点），F:ATTTTTAAATTTATATTTM，见SEQIDN0:3，R:ATTATTTTTATATATTTTTA，见SEQIDN0:4,以 修饰过的DNA为模板进行PCR，取PCR产物运用DHPLC技术检测甲基化。
[0015] (3)RT-PCR(Realtime-PCR,RT-PCR)检测TNF-αmRNA:取RNAlater固 定的脂肪组织300mg，采用TRI0L-步法提取网膜脂肪组织总RNA，取总RNA3ul逆 转录合成cDNA，随后设计引物，F:5' -GTGACAAGCCTGTAGCCCAT-3'，见SEQIDN0 :5， R: 5' -TATCTCTCAGCTCCACGCCA-3'，见SEQIDNO:6。以cDNA为模板进行PCR，取PCR产物 行琼脂糖凝胶电泳，对电泳带进行光密度扫描，表达量以TNF-α与内参GAPDH比值表示。
[0016] (4)统计学方法：采用SPSS13.0进行统计学分析，样本的一般资料用^±s表示， 一般资料的组间比较用独立样本t检验；各组样本DNA甲基化阳性率的比较用X2检验；目 的基因mRNA相对拷贝数以中位数及四分位间距[M(QmQ,)]表示，组间比较采用秩和检验； 相关性分析采用Pearson法。
[0017]2、DNA甲基化阳性率比较
[0018] 高效液相色谱技术（DHPLC)检测TNF-α基因启动子区甲基化情况，见图1。统计学 分析后发现，TNF-a基因启动子区DNA甲基化阳性率在NC(70. 0% )、0b(47. 9% )及T2DM 组（26. 9% )逐渐降低，差异具有统计学意义（P〈0. 01)。表明TNF-a基因启动子区的特定 区段DNA甲基化与新疆维吾尔族T2DM的发生发展相关。
[0019] 3、DNA甲基化与mRNA相对拷贝数相关性
[0020] 根据DNA甲基化情况将样本分为甲基化阳性和阴性组，比较两组mRNA相对拷贝 数，结果见图2。由图2可知，NC组（中位数：0.0250)，TNF-αmRNA相对拷贝数显著低于 〇b(中位数：0. 1096)及T2DM组（中位数：0. 0734)，差异具有统计学意义（P〈0. 05)。TNF-a 基因启动子区DNA甲基化阳性组mRNA相对拷贝数（0.0542)显著低于阴性组（0. 1988)，差 异具有统计学意义（P〈〇. 01)。表明TNF-a基因启动子区的特定区段DNA甲基化与其mRNA 表达水平呈正相关关系。
[0021] 综上，腹部脂肪组织细胞因子TNF-a基因启动子区甲基化差异导致其mRNA表达 水平差异与新疆维吾尔族T2DM的发生和发展相关。实施例2 :APN基因启动子区DNA甲基 化抑制其mRNA表达
[0022] 1、试验方法
[0023] (1)样本收集：各组于手术当日开腹后严格无菌操作取大网膜脂肪组织，约 3cmX3cm置于5mL冻存管内，标记住院号、姓名、性别，液氮冻存。避免电刀烧焦的脂肪，组 织表面血液过多时使用0. 9%生理盐水冲洗。
[0024] (2)基因组DNA提取：严格按照说明书进行，所有样本的A2M/A2S。比值在1. 7~2. 0 之间，DNA样本置于-20°C保存备用。
[0025] (3)DNA的亚硫酸氢盐修饰：取DNA样本1. 8μg，严格按照DNA甲基化修饰试剂盒 (EZ-DNAMethylationMkit，购自美国ZymoResearch公司）说明书步骤操作，对样本基因 组DNA进行亚硫酸盐修饰，每组挑取2个标本测序验证，-20°C保存DNA溶液。
[0026](4)阳性对照DNA的获得：抽取健康志愿者外周血3mL，用DNA提取试剂盒（上海 生工公司）提取基因组DNA，取8μLDNA，加2. 5μLCpG甲基化酶（M.SssI)和S-腺苷甲 硫氨酸，再加缓冲液于50yL体系，37°C孵育4h;采用EZ-DNAMethylationTMkit试剂盒 (购自美国Zymo Research公司）进行甲基化修饰，-20°C保存DNA溶液。
[0027] (5)生化指标测定：空腹血糖（Fastingplasmaglucose,FPG)采用葡萄糖氧化酶 法，总胆固醇（Totalcholesterol,TC)、甘油三酯（Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白（High densitylipoprotein,HDL-C)、低密度脂蛋白（Lowdensitylipoprotein,LDL-C)均米用 全自动生化分析仪检测；糖化血红蛋白（Glycosylatedhemoglobin,HbAlc)采用化学发光 法进行检测。
[0028] (6)DHPLC技术检测甲基化及结果判定：利用通用引物PCR扩增APN基因，引物 由上海生工生物技术服务有限公司合成。目的片段长度为525bp，PCR扩增体系25μL， 其中 10XPCR缓冲液（Mg2+plus)2. 5yL，dNTPMixture(各 2. 5mmol/L)2yL，上下游引物 (lOpmol/L)各lyL，热启动Taq酶（5U/L)0.5yL(TaKaRaTaql~HOtStartVersion，日 本），修饰后的DNA模板4μL，灭菌双蒸水加至总体积25μL。PCR扩增条件为：95°C预变性 1〇!1^11;95°(：变性3〇8,58.0°(：复性11^11，72°(：延伸11^11，共35个循环 ；最后再72°(：继续延续 10min。同时扩增甲基化酶（M.Sss1)修饰的正常人外周血DNA为甲基化阳性对照，灭菌双 蒸水取代处理后的DNA模板作为阴性对照。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳验证。取PCR 产物5μL，变性温度56. 4°C，运用变性高效液相色谱技术（Denaturinghighperformance liquidchromatography,DHPLC)对甲基化情况进行检测。
[0029] 检测过程中设甲基化阳性（Methylation,Μ)及阴性（Unmethylation,U)标准品， 以待测样品检测峰所处的位置判断其甲基化状态。若出现既有甲基化峰又有非甲基化峰的 混合状态，只要出现甲基化峰，就判定其为甲基化阳性，若没有出现甲基化峰则判定为甲基 化阴性。
[0030] (7)Rela-timePCR检测APNmRNA相对拷贝数
[0031] 取RNAlater固定的脂肪组织300mg，采用TRIZ0L-步法（RNA提取试剂盒TRIzol reagent,Invitrogen,美国）提取网膜脂肪组织总RNA。取总RNA3yL逆转录合成cDNA(逆 转录试剂盒ImProm-II?Promega，美国）。合成APNRela-timePCR及内参GAPDH引物序 列，见表1。
[0032] 表1-各种实时定量PCR引物序列表
[0034] 选择非特异性嵌合荧光染料SYBRGreenI用7500型荧光定量PCR仪（美国ABI 公司）对APN基因mRNA表达情况进行检测，2ΛACT计算mRNA相对拷贝数。
[0035] 2、DNA甲基化阳性率比较
[0036] 高效液相色谱技术（DHPLC)检测APN基因启动子区甲基化情况，见图3。统计学分 析后发现，APN基因启动子区DNA甲基化阳性率在正常对照（34%)、肥胖（47.9%)及T2DM 组（65. 4% )逐渐增加，差异具有统计学意义（P〈0. 05)。表明APN基因启动子区的特定区 段DNA甲基化与新疆维吾尔族T2DM的发生发展相关。
[0037] 3、DNA甲基化与mRNA相对拷贝数相关性
[0038] 结果见图4,Real-timePCR结果显示，正常对照组APNmRNA相对拷贝数 (0. 7162)显著高于肥胖（0. 4244)及T2DM组（0. 4093)，差异具有统计学意义（P〈0. 05)。 非T2DM个体相关性分析提示，APNmRNA相对拷贝数与空腹血清葡萄糖（Fasting plasmaglucose,FPG)、糖化血红蛋白（Glycosylatedhemoglobin,HbAf)、甘油三酯 (Triglyceride，TG)水平显著负相关（P〈0. 05)。APN基因启动子区DNA甲基化与其mRNA表 达负相关，甲基化阳性组相对拷贝数（0.2700)显著低于阴性组（0.7870)，差异具有统计学 意义（P〈0. 01)。
[0039] 综上，APN基因启动子区DNA甲基化通过抑制其mRNA表达导致糖脂代谢紊乱，参 与了新疆维吾尔族肥胖及T2DM的发生、发展过程。
【主权项】
1. 一种早期诊断预测2型糖尿病的分子标志物，其特征在于，为APN基因启动子区甲基 化或TNF-α基因启动子区甲基化，其中，所述APN的序列如SEQIDN0:1所示；所述TNF-a 的序列如SEQIDN0:2所示。2. 根据权利要求1所述的分子标志物在制备早期诊断预测2型糖尿病试剂盒中的应 用。
【专利摘要】早期诊断预测2型糖尿病的分子标志物及其应用，所述分子标志物为APN基因启动子区甲基化或TNF-α基因启动子区甲基化，其中，所述APN的序列如SEQ？ID？NO：1所示；所述TNF-α的序列如SEQ？ID？NO：2所示。本发明还包括分子标志物在制备早期诊断预测2型糖尿病试剂盒中的应用。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105274223
【申请号】CN201510684417
【发明人】张君, 谢建新, 王翠喆, 李伟, 许彭, 哈晓丹, 顾雅娟
【申请人】张君
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年10月20日