玉米线粒体丙酮酸转运体基因ZmNRGA1在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用
【专利说明】玉米线粒体丙酮酸转运体基因ZmNRGAI在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种玉米线粒体丙酮酸转运体基因的应用，尤其涉及一种玉米线粒体丙酮酸转运体基因ZmNRGAI (Gene ID: 100273562)在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用，属于分子生物学、基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002]通过生物信息学对已公布的玉米线粒体丙酮酸转运体基因ZmNRGAI基因序列(Gene ID: 100273562)分析，表明其编码一种线粒体丙酮酸转运体(MitochondrialPyruvate Carrier, MPC)。其转运胞质糖酵解的终产物一丙酮酸，进入线粒体内进行三羧酸循环。
[0003]根据玉米研究网站(http://www.maizegdb.0rg)提供的eFP Blowser结果显示，ZmNRGAI基因在植物叶片等部位大量表达。因植物表皮的气孔是蒸腾作用水分散失的主要通道，故调控气孔的张开和闭合，直接影响植物保水性及抗干旱能力。基于此，对玉米基因ZmNRGAI在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用研究，在改良作物，尤其是玉米的抗逆能力方面有重要的价值。但经检索，有关玉米线粒体丙酮酸转运体基因ZmNRGAI在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用文献目前还未见报道。
【发明内容】
[0004]针对现有研究的不足，本发明的目的是提供一种玉米线粒体丙酮酸转运体基因ZmNRGAI在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用。
[0005]本发明所述玉米线粒体丙酮酸转运体基因ZmNRGAI在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用。
[0006]申请人根据已公布的ZmNRGAI基因核苷酸序列(Gene ID: 100273562)，通过RT-PCR技术克隆该基因。在玉米中，ZmNRGAI因剪切方式不同有两种不同的基因序列，分别为ZmNRGAl_T01和ZmNRGAl_T02。本发明所述玉米丙酮酸线粒体转运体基因ZmNRGAI优选是玉米丙酮酸线粒体转运体基因ZmNRGAl_T02。本发明所述植物优选是拟南芥或玉米。
[0007]生物信息学分析显示，ZmNRGAl_T02是拟南芥NRGA1的同源基因。利用克隆到的基因片段ZmNRGAl_T02构建植物表达载体体pCM1307-ZmNRGAl_T02，经过分子学和遗传学操作转化拟南芥，得到ZmNRGAl_T02过表达植株(命名为0E1、0E5)。通过气孔运动、离体叶片失水率和植株干旱等实验方法对上述植株进行生理性状分析，ZmNRGAl_T02过表达植株(0EU0E5)相对对照组(拟南芥野生型Col-Ο)和空载体对照(EV)，在气孔运动中对ΑΒΑ弱敏感且抗干旱能力减弱，证实ZmNRGAI在植物抗干旱胁迫应答中起到重要的调节作用(见图1、图2、图3)。
[0008]本发明首次阐明了玉米线粒体丙酮酸转运体基因ZmNRGAI尤其是是玉米丙酮酸线粒体转运体基因ZmNRGAl_T02在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用，为利用ZmNRGAI基因改良植物体内的保水性及抗干旱能力奠定了基础，预示本发明的应用将有助于提高植物的抗旱胁迫能力，对培育抗旱高产的作物新品种有重要的理论指导意义，对我国农业生产具有巨大应用价值。
【附图说明】
[0009]图1:ZmNRGAl参与植物激素脱落酸(ΑΒΑ)调控气孔运动过程。
[0010]其中:0pen是指ΑΒΑ抑制气孔开放过程；Closure是指ΑΒΑ促进气孔关闭过程。[0011 ] 结果显示在ΑΒΑ抑制气孔开放和促进气孔关闭过程中，ZmNRGAI过表达株系(0E1、0E5)的气孔开度比野生型(Col-Ο)大，说明其参与ΑΒΑ调控气孔运动过程，过表达ZmNRGAI植株对ΑΒΑ弱敏感。
[0012]图2:ZmNRGAI改变植物离体叶片失水率。
[0013]同样条件下，统计离体叶片失水率。与野生型(Col-Ο)和空载体对照(EV)对比，ZmNRGAI过表达植株(0E1、0E5)失水快，说明ZmNRGAI可能通过参与气孔运动调控植物离体叶片失水，影响植物体内水分散失。
[0014]图3:ZmNRGAI参与植物抗干旱过程。
[0015]干旱处理下，与野生型(Col-Ο)和空载体对照(EV)对比，ZmNRGAI过表达株系(0EU0E5)抗干旱能力减弱，说明ZmNRGAI在植物抗干旱胁迫应答中起到重要的调节作用。
【具体实施方式】
[0016]以下实施例用于阐明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照产品制造生产厂商的使用说明。
[0017]实施例1玉米线粒体丙酮酸转运体基因ZmNRGAI转基因植株获得
[0018]1，PCR方法克隆ZmNRGAl_T02基因片段
[0019]以玉米自交系B73的cDNA为模板，以下面引物组合进行PCR扩增:
[0020]ZmNRGAl-BamHl-F:5’ -CGGGATCCCGATGGCTGCTACAAAGCTTCA-3’
[0021 ] ZmNRGA1-Kpnl-R:5’ -GGGTACCCTTACAACTTAAACTGATTGAGC-3’
[0022]PCR产物跑电泳后，切胶回收，纯化得到ZmNRGAl_T02基因片段。
[0023]2，载体连接和转化
[0024]首先用纯化后的ZmNRGAl_T02基因片段连接中间克隆载体Blunt (北京全式金公司产品)，转化大肠杆菌DH5a，通过抗生素筛选和菌落PCR得到阳性克隆；连接后的Blunt载体进行测序，证明得到的ZmNRGAl_T02核苷酸序列完全正确。
[0025]通过酶切组合BamHl/Kpnl将ZmNRGAl_T02核苷酸序列从Blunt载体中切下，再次胶回收连接植物表达载体PCM1307。
[0026]3，转基因植株的筛选和获得
[0027]连接正确的植物表达载体pCM1307-ZmNRGAl_T02转化农杆菌EHA105，通过农杆菌浸染的方法进行转基因操作，转入野生型植株，获得过表达株系。具体实施方法如下:
[0028]农杆菌感受态转化步骤:
[0029]1) _80°C冰箱中取出农杆菌感受态，冰浴融化，加入目的DNA，轻弹均匀，冰浴30分钟；
[0030]2)冰浴结束后，液氮速冻1分钟，紧接着37 °C水浴3-5分钟；
[0031]3)加入500 μ 1无抗生素LB液体培养基，28°C、振荡培养2_4小时；
[0032]4)培养结束后收集菌体，100 μ 1 LB液体培养基重悬，菌液涂布在YEP固体培养基(加相对应的抗生素)，28°C倒置培养2-3天；
[0033]5)挑取单克隆菌斑做菌落PCR鉴定。
[0034]农杆菌浸染拟南芥:培养约4周的拟南芥，待抽薹后，将主花序顶端减去，促进侧生花序生长。将已转化好的农杆菌菌液在转化前一天放大培养(按照2%接种)，28°C振荡培养过夜，至0D6M= 1.0-1.2,6000rpm离心15分钟收集菌体，用转化介质将菌液稀释至0D6M= 0.8-0.9，加入Sillwet至终浓度为0.02%。将花盆倒置，花序浸入转染液中20秒，花序上覆盖薄薄一层转染液，将花盆水平放置，在黑暗中培养24小时，随后22°C，长日照(16小时光照，8小时黑暗)培养，收取种子。
[0035]通过抗性筛选标记和PCR鉴定得到阳性转基因植株(0E1、0E5)。
[0036]实施例2玉米线粒体丙酮酸转运体基因ZmNRGAl_T02的转基因应用
[0037]利用ZmNRGAl_T02过表达植株(0E1、0E5)、进行下面生理性状实验，分析ZmNRGAl_T02在拟南芥或其他经济作物中对气孔运动调控及植物抗干旱方面的应用。
[0038]1，拟南芥气孔运动实验
[0039]外源ΑΒΑ抑制气孔开放(Opening)和促进气孔关闭(Closure)的实验。
[0040]Opening:
[0041]1)剪取生长四周的拟南芥莲座叶，放在Opening Buffer (10mM KCl，7.5mMiminodiacetic acid, lOmM Mes-KOH，pH 6.15)中，下表皮接触 Buffer，温室条件下避光处理；
[0042]2)2.5小时后，加ΑΒΑ到Opening Buffer中，终浓度为0_50 μ M，继续黑暗处理10分钟后，室温光照培养(450mol.mis1)；
[0043]3) 2.5小时后，撕取叶片下表皮，制作水压片，显微镜400放大倍数下拍照；
[0044]4)用统计软件ImageJ统计气孔开度。
[0045]Closure:
[0046]1)剪取生长四周的拟南芥莲座叶，放在Closure Buffer (20mM KCl，lmM CaCl2，5mMMes-KOH, pH 6.15)中，下表皮接触 Buffer，室温光照培养(450mol.mis1)；
[0047]2) 2.5小时后，加ΑΒΑ (脱落酸)到Closure Buffer中，终浓度为0-50 μ Μ，继续光照处理；
[0048]3) 2.5小时后，撕取叶片下表皮，制作水压片，显微镜400放大倍数下拍照；
[0049]4)用统计软件ImageJ统计气孔开度。
[0050]结果显示在ΑΒΑ抑制气孔开放和促进气孔关闭过程中ZmNRGAI过表达株系(0E1、0E5)的气孔开度比对照组Col-Ο大，说明过表达ZmNRGAI基因后植株对ΑΒΑ弱敏感(结果如图1所示)。
[0051 ] 2，拟南芥离体叶片失水率实验
[0052]生长四周左右的植株，选取生长健壮的莲座叶，剪取，放在温室条件下进行失水实验，分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8小时称量叶片重量，按照下面公式计算叶片失水率:
[0053]叶片失水率％ = (0小时重量-X小时重量)/0小时重量X 100
[0054]离体叶片失水结果如图2所示，同样条件下，统计各转基因植株的离体叶片失水率。与野生型(Col-Ο)和空载体对照(EV)相比，ZmNRGAl_T02过表达植株(0E1、0E5)失水快(结果如图2所示)。
[0055]3，拟南芥植株干旱实验
[0056]生长3-4周的植株，充分浇水后，停止浇水。在温室干旱处理，植株开始萎蔫至死亡时进行复水，3天后观察植株存活状态。在干旱处理后和复水3天后分别拍照(见图3)。
[0057]植株干旱实验结果如图3所示，干旱处理下，与野生型(Col-Ο)和空载体对照(EV)对比，ZmNRGAl_T02过表达(0E1、0E5)抗干旱能力减弱，说明ZmNRGAl在植物抗干旱胁迫应答中起到重要的调节作用，在培育抗旱作物新品种方面有潜在的应用价值。
【主权项】
1.玉米丙酮酸线粒体转运体基因ZmNRGAl在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述玉米丙酮酸线粒体转运体基因ZmNRGAl是玉米丙酮酸线粒体转运体基因ZmNRGAl_T02。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述植物是拟南芥或玉米。
【专利摘要】本发明公开了一种玉米丙酮酸线粒体转运体基因ZmNRGA1在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用，其中所述玉米丙酮酸线粒体转运体基因ZmNRGA1是玉米丙酮酸线粒体转运体基因ZmNRGA1_T02。经综合实验证实：ZmNRGA1_T02在植物激素脱落酸(ABA)调控气孔运动中起到负调控因子的作用，同时在植物应对干旱胁迫中有调控作用。预示本发明所述的应用将有助于改良植物的抗旱胁迫能力，对培育抗旱高产的作物新品种有重要的理论指导意义，对我国农业生产具有巨大应用价值。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/29, A01H5/00
【公开号】CN105296504
【申请号】CN201510868129
【发明人】张伟, 吴琪琪, 李春龙, 王美, 吴晓萌, 乔柱, 张尚立
【申请人】山东大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月1日