一种制备可皆霉素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于可皆霉素生产技术领域，具体设及一种制备可皆霉素的方法。 【背景技术】 阳00引可皆霉素为苯酿类化合物，分子式为〔32&為〇4;分子量：506. 22 ;CAS登录号： 11051-88-0,结构式为
阳00；3] 到目前为止，可皆霉素仅在毛壳属（紐36扣曲如曲分〇/7〇沉/巧^1?〇1?山7〇沁6〇中分 离得到。Brewerr的科研团队发现，在1-10Jig/ml时，可皆霉素抑制多属真菌的生长，并能 抑制真菌化Wis3心如和AwariiT?? 跑子的萌发，可皆霉素相对稳定，成 盐后，稳定性上升，其形成=乙胺盐后，水溶性显著增加，且溶解后能显著抑制多种微生物 质的生长（BrewerD,JerramWA,MeilerD,etal.Thetoxicityofcochliodinol,an 曰ntibioticmetaboliteofChaetomiumspp. {J\.CanadianJourn曰Iofmicrobiology, 1970，16: 433-440.)。同时发现可皆霉素在低浓度时，能够抑制多种镶刀菌的生长 (BrewerD,TaylorA.Theeffectofcochliodinol,ametaboliteofChaetomium cochliodes,ontherespirationofmicrosporesofFusarizimoxysporum\S]. CanadianJournalofmicrobiology, 1971, 17: 83-86.)，而镶刀菌可侵染多种植物（粮 食作物、经济作物、药用植物及观赏植物），引起植物多种病害，造成作物大量死亡，是生产 上防治最具挑战性的的病害之一，由此可见，其在植物病害防治方面的潜在应用价值非常 大。Casellada等研究发现可皆霉素具有显著细胞毒性，可W抑制人口腔上皮癌细胞邸和 乳腺癌细胞MDA-MB-435 的增殖，IC日。分别为 0. 53yM、2. 20yM，（CasellaTM,^arvier V,Mandavid,etal.Antimicrobialandcytotoxicsecondarymetabolitesfrom tropic曰IIesfendophytes:Isolstionof曰ntib曰cteri曰I曰gentpyrrocidineCfrom LewiainfectoriaSNB-GTC2402[J].Phytochemistry, 2013 96: 37〇-377)〇
[0004] 可皆霉素具有W上诸多生物活性，但是由于提取工艺的限制，产品含量低，而且合 成成本高，无法进行更深入研究。
【发明内容】
阳〇化]本发明的目的是提供一种原料成本较低、工艺简单、纯度高的提取可皆霉素的方 法。
[0006] 本实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种制备可皆霉素的方法，包括W下 步骤： (1) 菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种到平板培养基上，25°C恒溫培养72小时，获得活化 菌种； (2) 制备种子液：将步骤（1)中得到的活化菌种接种到装有无菌培养液A的无菌=角瓶 中，转速为15化pm，溫度为25°C条件下震荡培养72小时，获得种子液；培养液A的配方为： 膜蛋白腺lOg/L酵母提取物5g/L，氯化钢lOg/L口册.0 + 0. 1; (3) 发酵培养：将步骤（2)制备的种子液与培养液B按照体积比为5 :100接入到无菌S 角瓶中，转速为15化pm，溫度为25°C条件下震荡培养7山获得发酵液；培养液B的配方为： 葡萄糖40g/l，蛋白腺10g/l，酵母粉10g/L，抑6.0 + 0. 1; (4) 乙酸乙醋提取物的制备：将步骤（3)制备的发酵液用医用纱布过滤，得到狭旋毛壳 菌体，将狭旋毛壳菌体用乙酸乙醋提取，得到乙酸乙醋提取液，31~33°C下减压除去乙酸乙 醋后得到乙酸乙醋提取物； (5) 可皆霉素的制备：将步骤（4)制备的乙酸乙醋提取物用80~100目硅胶拌样后装 柱，固定相为200~300目硅胶，W二氯甲烧一甲醇梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯 甲烧-甲醇的体积比为100 : (2~4)的流份，31~33°C下减压除去二氯甲烧和甲醇，得可皆霉 素。
[0007] 所述步骤（1)中平板培养基配方为：酵母膏lOg/l，葡萄糖40g/l，蛋白腺10旨/1，琼 脂粉20邑/1，抑6. 0 + 0. 1。
[0008] 所述步骤（4)中将将狭旋毛壳菌体用乙酸乙醋提取时，用乙酸乙醋提取3次，每次 提取时20~25°C冷浸10小时，每次提取时狭旋毛壳菌体与乙酸乙醋的固液比为Ig: 30ml。
[0009] 所述步骤（5)中将乙酸乙醋提取物与硅胶拌样时，乙酸乙醋提取物与80~100目 硅胶的重量比为1 : 2。
[0010] 本发明产生的有益效果是：本发明W球壳科毛壳属狭旋毛壳为原料进行可皆霉 素的提取，提取方法简单，成本低，具有可持续性，提取得到可皆霉素单体，提取过程中用到 的溶剂可回收利用，提取量大，可工业化生产。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1 本实施列的制备可皆霉素的方法包括W下步骤： (1) 菌种活化 将狭旋毛壳菌种(来自于美国模式培养物集存库，菌种编号：ATCCNO. 56725)接种到 平板培养基上，25°C恒溫培养72小时，获得活化菌种；平板培养基配方为：酵母膏10肖/1，葡 萄糖40g/l，蛋白腺lOg/l，琼脂粉20g/l，口册.0 + 0. 1; (2) 制备种子液：将步骤（1)中得到的活化菌种接种到装有无菌培养液A的无菌=角瓶 中，转速为15化pm，溫度为25°C条件下震荡培养72小时，获得种子液；培养液A的配方为： 膜蛋白腺lOg/L酵母提取物5g/L，氯化钢lOg/L口册.0 + 0. 1; (3) 发酵培养：将步骤（2)制备的种子液与培养液B按照体积比为5 :100接入到无菌S 角瓶中，转速为15化pm，溫度为25°C条件下震荡培养7山获得发酵液；培养液B的配方为： 葡萄糖40g/^，蛋白腺10g/^，酵母粉10g/L，抑6.0±0.1; (4) 乙酸乙醋提取物的制备：将步骤3制备的发酵液用医用纱布过滤，得到狭旋毛壳菌 体，将菌体用乙酸乙醋提取3次(每次23°C下冷浸10小时，每次提取时狭旋毛壳菌体与乙酸 乙醋的固液比为Ig: 30ml)，得到乙酸乙醋提取液，通过旋转蒸发仪31~33°C下减压除去乙 酸乙醋后得到乙酸乙醋提取物； (5) 可皆霉素的制备：将步骤4制备的乙酸乙醋提取物用80~100目硅胶拌样后装柱， 固定相为200~300目硅胶，乙酸乙醋提取物与80~100目硅胶的重量比为1:2,W二氯甲 烧一甲醇梯度洗脱（二氯甲烧一甲醇体积比为100:0 ;1〇〇:1 ;1〇〇:2 ;100:4 ;100:8)，W娃 胶薄层层析，紫外254nm检测，合并二氯甲烧-甲醇的体积比为100 :2和100:4的流份，旋 转蒸发仪31~33°C下减压除去二氯甲烧和甲醇，得可皆霉素(纯度为98. 76%)。
[0012] 采用本实施例的方法所提取到的可皆霉素的结构鉴定如下： 【性状】紫色粉末 【鉴定】分子式：〔32&术2〇4,分子量：506. 2206 仪器设备：Agilent1100液相色谱仪，化"CNMR图谱由Brukeram-400MHz核磁 共振仪测定（TMS为内标），质谱由Agilent6490型质谱仪测定。 阳〇1引 利用ESI-MS/HNMR和"CNMR试验，标准数据如下击51-]?8曲/^:505.2124 []\1- 田+ ;Ihnmr(CDCI3，400MHz)《：8.41 (1H,S,2,5-0H),8. 13 (1H,S,1-畑），7.60 (1H,S,H-。，7.44 (1H,S,H-4), 7.34 (1H,d,/=8.4，H-7), 7.08 (1H,d, / = 8.4，H-6), 5.40 (1H,m,H-11), 3.46 (1H,m,H-10), 1.75 (3H,S,I3-CH3)，1.74 (1H,S,I4-CH3) ; 口CNMR(CDCI3，100MHz)《：1：M. 4 (C-8)，133.9 (C-5)，131. 7 (C-12), 127.2 (C-2), 126.3 (C-9), 124.5 (C-11), 123.6 (C-6), 120.9 (C-4), 111.1 (C-7), 110.8 (C-3,C-6), 104.4 (C-3), 34.7 (C-IO), 25.8 (C-14), 17.9 (C-13). 【检查】利用化C，在UV 254皿呈强巧光；W硫酸显色剂，110°C下20秒钟，呈现栋色。
[0014]【含量测定】利用HPLC，色谱条件：Se^paxGP-C18Sym(250mmX4.6mm)色谱柱。 流动相：乙腊：水：甲酸为10 : 90 : 0. 1 ;流速：1. 25血/min,检测波长254皿，保留时间 值 9.46min。
[0015] 最后所应说明的是：W上实施例仅用W说明，而非限制本发明的技术方案，尽管 参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可W对 本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其 均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种制备可皆霉素的方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种到平板培养基上，25°C恒温培养72小时，获得活化 菌种； (2) 制备种子液：将步骤（1)中得到的活化菌种接种到装有无菌培养液A的无菌三角瓶 中，转速为150rpm，温度为25°C条件下震荡培养72小时，获得种子液；培养液A的配方为： 胰蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH6. 0±0. 1 ; (3) 发酵培养：将步骤（2)制备的种子液与培养液B按照体积比为5 :100接入到无菌三 角瓶中，转速为150rpm，温度为25°C条件下震荡培养7d，获得发酵液；培养液B的配方为： 葡萄糖 40g/L，蛋白胨 10g/L，酵母粉 10g/L，pH6.0±0.1; (4) 乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（3)制备的发酵液用医用纱布过滤，得到狭旋毛壳 菌体，将狭旋毛壳菌体用乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯提取液，31~33°C下减压除去乙酸乙 酯后得到乙酸乙酯提取物； (5) 可皆霉素的制备：将步骤（4)制备的乙酸乙酯提取物用80~100目硅胶拌样后装 柱，固定相为200~300目硅胶，以二氯甲烷一甲醇梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯 甲烷-甲醇的体积比为100 :(2~4)的流份，31~33°C下减压除去二氯甲烷和甲醇，得可皆霉 素。2. 如权利要求1所述的制备可皆霉素的方法，其特征在于：所述步骤（1)中平板培养基 配方为：酵母膏10g/L，葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，琼脂粉20g/L，ρΗ6· 0±0· 1。3. 如权利要求1中所述的制备可皆霉素的方法，其特征在于：所述步骤（4)中将狭旋毛 壳菌体用乙酸乙酯提取时，用乙酸乙酯提取3次，每次提取时于20~25°C冷浸10小时，每次 提取时狭旋毛壳菌体与乙酸乙酯的固液比为lg: 30ml。4. 如权利要求1中所述的制备可皆霉素的方法，其特征在于：所述步骤（5)中将乙酸乙 酯提取物与80~100目硅胶拌样时，乙酸乙酯提取物与80~100目硅胶的重量比为1 : 2〇
【专利摘要】本发明涉及一种制备可皆霉素的方法，将狭旋毛壳菌种活化后制备种子液，将种子液发酵培养，将发酵培养得到的菌体用乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯提取物，再将乙酸乙酯提取物分离后得到可皆霉素。本发明以球壳科毛壳属狭旋毛壳为原料进行可皆霉素的提取分离，方法简单，成本低，具有可持续性，分离得到可皆霉素单体，提取分离过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可工业化生产。
【IPC分类】C12P17/16, C12R1/645
【公开号】CN105296566
【申请号】CN201510878111
【发明人】陈林, 郭庆丰, 马经纬, 尹震花, 张娟娟, 康文艺
【申请人】黄河科技学院
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月4日