一种槲皮素与鼠李糖加热生成物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于止血化合物技术领域，具体涉及一种槲皮素与鼠李糖加热生成物及其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 槐花为豆科植物槐（Sophora japanica L.)的干燥花及花蕾，有凉血止血，清肝泻 火之效。用于便血、痣血、血痢、崩漏、吐血，衄血。植物化学研究显示槐花的主要化学成分 是黄酮、异黄酮、类异黄酮。槐花炭是槐花的法定炮制品，炒炭后味苦涩，清热凉血作用弱， 以止血力胜。
[0003] 槲皮素，又名栎精，槲皮黄素，溶于冰醋酸，碱性水溶液呈黄色，几乎不溶于水，乙 醇溶液味很苦。可作为药品，具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。此外还有 降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流 量等作用。用于治疗慢性支气管炎。对冠心病及高血压患者也有辅助治疗作用。
[0004] 鼠李糖，6-脱氧-L-甘露糖，广泛存在于植物的多糖、糖苷、植物胶和细菌多糖中。 其甜度为蔗糖的33%，可用来测定肠道的渗透性，可用作甜味剂，还可用于生产香精香料， 可食用。
【发明内容】
[0005] 解决的技术问题：本发明一种槲皮素与鼠李糖加热生成物及其制备方法和应用， 经体外活性实验验证其具有较好的止血作用。
[0006] 技术方案：一种槲皮素与鼠李糖加热生成物的制备方法，制备步骤为：槲皮素与 鼠李糖分别以摩尔比为1: (1~4)，于200°C~250°C马弗炉中加热反应10_30min。
[0007] 优选的，上述槲皮素与鼠李糖的反应比例为1: 3。
[0008] 优选的，上述加热反应为250°C马弗炉中加热反应10min-15min。
[0009] 优选的，上述加热反应为200°C马弗炉中加热反应25min-30min。
[0010] 上述制备方法所制得的槲皮素与鼠李糖加热生成物。
[0011] 上述槲皮素与鼠李糖加热生成物在制备止血药物中的应用。
[0012] -种止血药物，有效成分为上述的槲皮素与鼠李糖加热生成物。
[0013] 加热时间需严格控制。加热时间过长或过短，槲皮素与鼠李糖加热反应无法生成 该生成物。
[0014] 有益效果：本发明生成物能缩短APTT和PT，具有促凝血活性，且表现为剂量依赖 关系。体外止血活性实验结果表明，本发明生成物具有良好的止血活性，表现为促进血浆血 小板聚集和促凝血活性。
【附图说明】
[0015] 图1为实施例1的HPLC-MS/MS分析验证图；
[0016] 图2为实施例2的HPLC-MS/MS分析验证图；
[0017] 图3为实施例3的HPLC-MS/MS分析验证图；
[0018] 图4为实施例4的HPLC-MS/MS分析验证图；
[0019] 图5为实施例5的HPLC-MS/MS分析验证图；
[0020] 图6为实施例6的HPLC-MS/MS分析验证图；
[0021] 图7为实施例7的HPLC-MS/MS分析验证图；
[0022] 图8为实施例8的HPLC-MS/MS分析验证图；
[0023] 图9为实施例9的HPLC-MS/MS分析验证图；
[0024] 图10本发明实例2生成物对ADP、胶原、凝血酶诱导的新西兰兔血浆血小板聚集的 影响示意图（X 土SD，n=6 );
[0025] 图11本发明实例2生成物对新西兰兔血浆APTT的影响示意阁（x:t_SD, n=6 );
[0026] 图12本发明实例2生成物对新西兰兔血浆PT的影响示意图（[土SD, n=6
[0027] 图13本发明不同实例生成物对ADP、胶原、凝血酶诱导的新西兰兔血浆血小板聚 集的影响示意图（I士SD, n=6 :?
[0028] 图14本发明不同实例生成物对新西兰兔血浆APTT的影响示意图（n=6 ):丨
[0029] 图15本发明不同实例生成物对新西兰兔血浆PT的影响示意图（7士SD, n=6 )。
【具体实施方式】
[0030] 本发明所述的生成物是从槲皮素和鼠李糖加热反应并经HPLC-MS/MS分析等方法 确定得到。以下结合实际情况，对本发明的【具体实施方式】进行详细说明：
[0031] 实施例1
[0032] 0· 164g 鼠李糖（0· OOlmol)与 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩埚，混合均 匀，于250°C马弗炉中加热5min。加热反应产物经HPLC-MS/MS分析验证，结果见图1。
[0033] 实施例2
[0034] 0· 164g 鼠李糖（0· OOlmol)与 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩埚，混合均 匀，于250°C马弗炉中加热10min。加热反应产物经HPLC-MS/MS分析验证，结果见图2。
[0035] 实施例3
[0036] 0· 164g 鼠李糖（0· OOlmol)与 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩埚，混合均 匀，于250°C马弗炉中加热20min。加热反应产物经HPLC-MS/MS分析验证，结果见图3。
[0037] 实施例4
[0038] 0· 328g 鼠李糖（0· 002mol)与 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩埚，混合均 匀，于250°C马弗炉中加热10min。加热反应产物经HPLC-MS/MS分析验证，结果见图4。
[0039] 实施例5
[0040] 0· 492g 鼠李糖（0· 003mol)与 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩埚，混合均 匀，于250°C马弗炉中加热10min。加热反应产物经HPLC-MS/MS分析验证，结果见图5。
[0041] 实施例6
[0042] 0· 656g 鼠李糖（0· 004mol)与 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩埚，混合均 匀，于250°C马弗炉中加热lOmin。加热反应产物经HPLC-MS/MS分析验证，结果见图6。
[0043] 实施例7
[0044] 0· 164g 鼠李糖（0· OOlmol)与 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 lOOmL 坩埚，混合均 匀，于200°C马弗炉中加热15min。加热反应产物经HPLC-MS/MS分析验证，结果见图7。
[0045] 实施例8
[0046] 0· 164g 鼠李糖（0· OOlmol)与 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩埚，混合均 匀，于200°C马弗炉中加热25min。加热反应产物经HPLC-MS/MS分析验证，结果见图8。
[0047] 实施例9
[0048] 0· 164g 鼠李糖（0· OOlmol)与 0· 302g 槲皮素（0· OOlmol)置于 100mL 坩埚，混合均 匀，于200°C马弗炉中加热35min。加热反应产物经HPLC-MS/MS分析验证，结果见图9。
[0049] 实施例10
[0050] 本发明实施例2、实施例4及实施例5生成物体外止血活性测定
[0051] 1.样品准备
[0052] 将不同实例生成物溶解于含二甲亚砜（DMS0)的生理盐水溶液中（DMS0的终浓度 为2 % )制得储备液。将储备液稀释至终浓度为100 μ Μ用于血小板聚集，终浓度为50 μ Μ 用于促凝血实验。以2% DMS0为空白对照（Cont)，酚磺乙胺（5 μ g/mL)和血凝酶（0. lku/ mL)为阳性对照。
[0053] 2.血液收集和处理
[0054] 普通级雄性新西兰兔，体重2. 5kg_3kg，实验前标准实验室饮食自来水适应性喂养 一星期，实验当天早上用戊巴比妥钠（50mg/kg)麻醉后，兔颈总动脉插管取血，与0. 109M的 朽1檬酸三钠按9:1均勾混合，经抗凝后的全血用于观察血小板聚集。全血以2500Xg离心 15min，收集上层液体（血浆）用于观察促凝血活性。
[0055] 3.促血小板聚集实验
[0056] 抗凝全血以800rpm/min离心10min，收集上层富血小板血浆（PRP)，剩余部分以 3000rpm/min离心10min，收集贫血小板血衆（PPP)。向PRP中加入PPP调节血小板数量为 4X1012-5X1012。在塑料测试杯中，加入290 yL PPP和10yL溶剂DMS0调零。10yL生成 物溶液和290 yL PRP加入到测试杯中，37°C温育，5min后加入10yL ADP、胶原、凝血酶（终 浓度分别为0. 05 ymol/L、0. 03 μ g/mL、0. 01U/mL)，测定血小板6min内的最大聚集率。本实 验采用的是比浊法。测定前用DMS0调零。实验在取血后2h内完成。
[0057] 4.促凝血实验
[0058] 按照试剂盒说明书测定活化部分凝血活酶时间（APTT)和凝血酶原时间（PT)。这 里作简要说明，APTT试剂平衡至室温，Cacl2预热至37°C，45 μ L血浆、5 μ L各单体样品溶 液和ΑΡΤΤ试剂50 μ L混匀后37°C孵育3min，再加50 μ L预热的Cacl2试剂，计时；ΡΤ试剂 37°C预热15min，45 μ L血浆和5 μ L各单体样品溶液混匀后37°C孵育3min，再加100 μ L预 热的ΡΤ试剂，计时。APTT和ΡΤ的结果值以秒表示。
[0059] 5.实验结果
[0060] 图10表示的是本发明实施例2生成物对新西兰兔血浆ADP、胶原和凝血酶诱导的 血小板聚集的影响。结果表明，本发明实施例2生成物能促进胶原诱导的血小板聚集，且表 现为剂量依赖关系。图11、图12表示的是本发明实施例2生成物对新西兰兔血浆APTT和 PT的影响。结果表明，本发明实施例2生成物能缩短APTT和PT，具有促凝血活性，且表现 为剂量依赖关系。体外止血活性实验结果表明，本发明生成物具有良好的止血活性，表现为 促进血浆血小板聚集和促凝血活性。
[0061] 图13、图14和图15分别比较了不同实例对新西兰兔血浆ADP、胶原和凝血酶诱导 的血小板聚集、对新西兰兔血浆ΑΡΤΤ和ΡΤ的影响。结果表明，止血活性强弱顺序为实例5 >实例4 >实例2,说明工艺5优于工艺、工艺2,鼠李糖与槲皮素的最佳比例为3:1。
【主权项】
1. 一种槲皮素与鼠李糖加热生成物的制备方法，其特征在于制备步骤为：槲皮素与鼠 李糖分别以摩尔比为1: (1~4)，于200°C~250°C马弗炉中加热反应10-30min。2. 根据权利要求1所述槲皮素与鼠李糖加热生成物的制备方法，其特征在于所述槲皮 素与鼠李糖的反应比例为1:3。3. 根据权利要求1所述槲皮素与鼠李糖加热生成物的制备方法，其特征在于所述加热 反应为250°C马弗炉中加热反应10min-15min。4. 根据权利要求1所述槲皮素与鼠李糖加热生成物的制备方法，其特征在于所述加热 反应为200°C马弗炉中加热反应25min-30min。5. 权利要求1~4任一所述制备方法所制得的槲皮素与鼠李糖加热生成物。6. 权利要求5所述槲皮素与鼠李糖加热生成物在制备止血药物中的应用。7. -种止血药物，其特征在于有效成分为权利要求1~4所述的槲皮素与鼠李糖加热生 成物。
【专利摘要】一种槲皮素与鼠李糖加热生成物及其制备方法和应用，制备步骤为：槲皮素与鼠李糖分别以摩尔比为1:（1~4），于200℃~250℃马弗炉中加热反应10-30min。本发明生成物能缩短APTT和PT，具有促凝血活性，且表现为剂量依赖关系。体外止血活性实验结果表明，本发明生成物具有良好的止血活性，表现为促进血浆血小板聚集和促凝血活性。
【IPC分类】A61K31/7048, C07H15/26, C07H17/07, A61P7/04, C07H1/00
【公开号】CN105315317
【申请号】CN201510724042
【发明人】吴皓, 陈叶青, 郁红礼, 王欣之, 李伟
【申请人】南京中医药大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年10月29日