一种从红豆杉中培养筛选产紫杉醇菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种从红豆杉中培养筛选产紫杉醇菌的方 法。
【背景技术】
[0002] 紫杉醇最早从短枝红豆杉（Taxusbreviifolia)的树皮中分离得到，命名为紫杉 醇。紫杉醇随后被证实具有独特的抗癌机制，由于其独特的抗癌机制，对于普通抗癌药物 无能为力的某些晚期肿瘤均有良好疗效，并且对于多种临床恶性肿瘤疗效突出，完全不同 于以往上市的任何一种抗癌药。美国食品与药物管理局（FDA)于1992年12月正式批准紫 杉醇用于临床。
[0003] 由于红豆杉已经作为濒危物种被列为国家一级保护植物，显然从红豆杉植物组织 中提取紫杉醇已受到极大的限制，同时红豆杉树皮中紫杉醇含量很低，药源极其有限，远不 能满足临床用药需要。红豆杉细胞组织培养需要的条件严格且产量低而化学合成成本昂 贵，因此这两种途径均不适合大量获取紫杉醇。而微生物发酵法生产紫杉醇，它是不需依赖 红豆杉而极具工业化生产潜力的方法，但是通过目前所具有的方法筛选出来的紫杉醇菌产 紫杉醇的含量低，并不能满足工业要求。因此，寻求一种从红豆杉分离到产紫杉醇效率高的 内生真菌，将会为紫杉醇的微生物工程提供一条更广阔的途径。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种从红豆杉分离到产紫杉醇效率 高的内生真菌的方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种从红豆杉中培养筛选产紫杉醇菌的方法，包括如下步骤：
[0007] 1)对红豆杉植物的组织进行培养，分离纯化获得内生真菌；
[0008] 2)培养步骤1)中获得的内生真菌，利用薄层层析对发酵代谢物进行初筛，筛出可 产紫杉醇或其类似物的菌株；
[0009] 3)结合细胞毒性实验，测定出代谢物对CH0细胞的抑制率；
[0010] 4)利用高效液相色谱做进一步分析，确定产紫杉醇菌株。
[0011] 上述的从红豆杉中培养筛选产紫杉醇菌的步骤，优选为：
[0012] 1)对红豆杉植物的组织消毒后在固体培养基上进行培养数天到数十天，分离纯化 获得内生真菌，并做空白对照试验排除空气中真菌；
[0013] 2)液体培养步骤1)中获得的内生真菌，利用薄层层析对这些内生真菌的发酵代 谢物进行初筛，筛出可产紫杉醇或其类似物的菌株；
[0014] 3)结合细胞毒性实验，用Resazurin法检测生长抑制率，对经初步筛选出的次生 代谢产物进行体外抗肿瘤活性试验，测定出代谢物对CH0细胞的抑制率；
[0015] 4)通过高效液相色谱做进一步分析，确定产紫杉醇菌株。
[0016] 上述的红豆杉植物的组织是树皮、树叶或果实。
[0017] 本发明的另一目的在于提供通过上述方法获得的产紫杉醇菌株。
[0018] 上述产紫杉醇菌株已于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号）保藏号为CGMCC No. 9251。 该保藏的生物材料的分类命名为：木霉（Trichoderma sp.)。
[0019] 本发明的再一个目的是提供一种含有上述产紫杉醇菌株的生物制剂。
[0020] 本发明提供的筛选产紫杉醇菌的方法，可根据内生真菌培养的需要调整固体培养 基的营养成分和最佳的内生真菌生长环境条件，尽可能多培养出产紫杉醇的内生真菌。同 时做了空白对照实验，排除空气中的真菌的干扰影响。然后通过TLC和HPLC检测并结合肿 瘤模型实验筛选来确定产紫杉醇菌，能尽快使从真菌发酵途径获取紫杉醇扩大实验提供有 价值的实验参考数据。因此，本发明提供的从黄山地区红豆杉果实中培养并筛选产紫杉醇 菌的技术是高效、操作简单和切实可行的方法。该方法筛选产紫杉醇菌用于微生物培养获 得紫杉醇的含量大大增加，为微生物工程提供了更广阔的途径。
[0021] 可见，将本发明提供的方法对我国这些珍稀药用植物的内生真菌进行的研究和开 发，对于开发我国植物内生真菌的药用资源以及濒危药用植物的生态保护等均具有重要的 理论意义和潜在的应用价值。
【附图说明】
[0022] 图1为薄层层析对这些内生真菌的发酵代谢物进行分析的初筛图。
[0023] 图2为紫杉醇标准品的HPLC图谱。
[0024] 图3为HQ-24代谢物的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本 发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0026] 实施例
[0027] 将新鲜的黄山地区红豆杉果实切成1cm2小块。把果实浸泡于75%酒精5min左右， 接种于如下平板培养基中：马铃薯20gL \葡萄糖20gL \琼脂20gL 1和葡萄糖40gL \蛋白 胨10gL \酵母浸出粉10gL \琼脂20gL \在25°C培养箱中培养8天。待菌落从切口处长出 后，观察培养皿中材料切口处长出菌丝（菌落），挑取切口处菌丝尖端转接到新的平板培养 基上培养，待长成菌落后，根据菌落形态、颜色的差异及长出时间的不同，分别挑取其边缘 的菌丝进行分离培养，观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况，并做相应记录。采用菌丝 顶端纯化法如此反复纯化后，转入PDA斜面培养基上，于28 °C培养箱中培养6d后，对菌株进 行编号，并放入4°C冰箱保存。将分离纯化后得到的菌株进行液体培养，25°C，转速为120r/ min摇床中培养10d。将培养好的发酵液抽滤，分离出发酵液。发酵液采用低温真空浓缩处 理，浓缩至原体积的1/5后用等体积的乙醚和乙酸乙酯萃取多次后，将有机相浓缩近于lml 备用。
[0028] 用紫杉醇标准品溶液作为对照，样品用毛细管在GF254高效薄层硅胶板点样，点 样后放入层析缸中展开，层析后取出硅胶板，在薄层板上喷显色剂，再观察斑点的位置和颜 色，结果见图1，通过该图可发现共有8个菌株（分别为HQ-2、HQ-5、HQ-41、HQ-67、HQ-24、 HQ-40、HQ-69、HQ-71)的发酵液提取物在薄层板上均能产生紫杉醇的特征性斑点出现，根据 原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf)，其比移值Rf均与紫杉醇的标准 品相同。对经TLC筛选出的8株经醇沉处理的筛选出红豆杉内生真菌菌株发酵液冻干品用 12. 5%的DMSO配成1. Omg/ml的样品溶液，用CHO Cytotoxicity Assay模型进行测定，样 品的测试终浓度为100 μ g/ml。对经上述筛选出的代谢产物进行体外抗肿瘤活性试验，于 37°C、5% C02培养箱中培养72h。酶标仪检测，测定出代谢物对CH0细胞的抑制率。测定结 果见表1，表明8株菌株的代谢物对CH0细胞的抑制率均较大，可见该菌株的代谢物细胞毒 活性较大。其中HQ-24的代谢物对CH0细胞的抑制率达到70%以上，该菌株的代谢物细胞 毒活性最大。
[0029] 表1 8株红豆杉内生真菌代谢物对CH0细胞的细胞毒性
[0031] 再通过高效液相色谱对抑制率较高发酵物（HQ-24)做了进一步分析，利用HPLC建 立紫杉醇标准曲线，结果见图2和图3,结果发现HQ-24菌株发酵代谢物的吸收峰与紫杉醇 标准品吸收峰保留时间一致，可确定该菌为产紫杉醇菌。可见，其他样品也均为产紫杉醇 菌，最后对产紫杉醇菌进行鉴定，属于木霉（Trichoderma sp.)。
【主权项】
1. 一种从红豆杉中培养筛选产紫杉醇菌的方法，其特征是，包括如下步骤： 1) 对红豆杉植物的组织进行培养，分离纯化获得内生真菌； 2) 培养步骤1)中获得的内生真菌，利用薄层层析对发酵代谢物进行初筛，筛出可产紫 杉醇或其类似物的菌株； 3) 结合细胞毒性实验，测定出代谢物对CHO细胞的抑制率； 4) 利用高效液相色谱做进一步分析，确定产紫杉醇菌株。2. 根据权利要求1所述的从红豆杉中培养筛选产紫杉醇菌的方法，其特征是，包括如 下步骤： 1) 对红豆杉植物的组织消毒后在固体培养基上进行培养数天到数十天，分离纯化获得 内生真菌，并做空白对照试验排除空气中真菌； 2) 液体培养步骤1)中获得的内生真菌，利用薄层层析对这些内生真菌的发酵代谢物 进行初筛，筛出可产紫杉醇或其类似物的菌株； 3) 结合细胞毒性实验，用Resazurin法检测生长抑制率，对经初步筛选出的次生代谢 产物进行体外抗肿瘤活性试验，测定出代谢物对CHO细胞的抑制率； 4) 通过高效液相色谱做进一步分析，确定产紫杉醇菌株。3. 根据权利要求1或2所述的从红豆杉中培养筛选产紫杉醇菌的方法，其特征是，所述 红豆杉植物的组织是树皮、树叶或果实。4. 通过权利要求1所述的方法所获得的产紫衫醇菌株。5. 根据权利要求4所述的产紫衫醇菌株，其保藏号为CGMCCNo. 9251。6. 含有权利要求4或5所述的产紫衫醇菌株的生物制剂。
【专利摘要】本发明提供了一种从红豆杉中培养筛选产紫杉醇菌的方法。本发明的方法包括以下步骤：1)对红豆杉植物的组织进行培养，分离纯化获得内生真菌；2)培养步骤1)中获得的内生真菌，利用薄层层析对发酵代谢物进行初筛，筛出可产紫杉醇或其类似物的菌株；3)结合细胞毒性实验，测定出代谢物对CHO细胞的抑制率；4)利用高效液相色谱对其作了进一步分析，确定产紫杉醇菌株。本发明提供的从红豆杉分离产紫杉醇的方法过程简单，成本较低。并且通过本发明提供的方法提取得到的产紫杉醇菌用于微生物培养时，获得紫杉醇的含量大大增加，该方法为微生物工程提供了更广阔的途径。CGMCC No925120140526
【IPC分类】C12N1/14, C12R1/885
【公开号】CN105316238
【申请号】CN201410300629
【发明人】汪友明, 樊美珍, 马忠友, 胡丰林, 张袖丽, 田超, 陆瑞利
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年6月25日