一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体，属于酶工程领域。
【背景技术】
[0002] 果胶酶是一种复合酶，能够将果胶聚合物分解成不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶分 布广泛，在部分寄生线虫、植物和微生物内都有发现。果胶酶应用广泛，已有40多年的工业 应用史。根据最适反应pH的不同将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶PGL。其中酸性果 胶酶主要应用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果实脱皮等方面。PGL应用主要应用于纺织、食 品、造纸行业和环境领域。应用酶法作用上述领域相关反应具有环保、节约原料耗材和反应 条件温和等优点。然而目前对PGL进行分子改造研究较少，进行商品化的PGL也很少。
[0003] 目前对碱性果胶酶研究比较深入的菌株主要是毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆 菌。综合比较可表达碱性果胶酶的不同宿主，毕赤酵母虽然表达蛋白易于纯化，产量高，但 发酵周期长、过程复杂、低温诱导耗能高；枯草芽孢杆菌不易表达或表达酶活低等缺点。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明以前期研究的在PGL蛋白N端以PT-Linker连接一段 正负电荷交替（亲疏水性交替）的双亲短肽（AEAEAKAKAEAEAKAK，即SEQIDNα3)，简称 PGL-S1，为出发序列，对其进行进一步分子改造，将其中的双亲短肽S1的重复单元进行有 序截短，截短至Sl-1 (AEAEAKAK，即SEQ ID N0. 4)，比酶活提高5. 7倍。
[0005] 本发明提供了一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体，其氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列，突变体简称PGL-S1-1。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体的核苷酸序列是SEQ ID N0. 2所示的序 列。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将原有融合蛋白的短肽序列进行优化 改造。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是原有融合双亲短肽的碱性果胶酶的双 亲短肽进行有序截短。
[0009] 本发明还提供一种表达所述突变体的基因工程菌。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述基于工程菌为大肠杆菌。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主、pET-22b(+)为 载体，表达碱性果胶酶突变体。
[0012] 本发明还要求保护编码所述突变体的核苷酸序列，以及所述突变体和基因工程菌 在食品、纺织或造纸方面的应用。
[0013] 有益效果：相对于现有的突变体PGL-S1而言，本发明的突变体PGL-S1-1的比酶活 提高了 5. 7倍，而且热稳定性没有受到影响，在60°C的半衰期及Tm值没有改变。本发明的 碱性果胶酶可在碱性条件下催化通过反式消去作用聚半乳糖醛酸的a -1，4糖苷键裂解， 广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。
【具体实施方式】：
[0014] 培养基：
[0015] 种子培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，葡萄糖2g/L。
[0016] 发酵培养基：蛋白胨 12g/L、酵母粉 24g/L、甘油 10g/L、KH2P04 2. 32g/L、Κ2ΗΡ0416.43g/L〇
[0017] 碱性果胶酶酶活测定：
[0018] 采用分光光度法测定。单位酶活定义：单位时间裂解聚半乳糖醛酸产生1 ymol 的不饱和聚半乳糖醛酸所用的酶量。酶活测定条件为：酶活力检测：发酵液SOOOrpm离心 10min，胞外PGL即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测。PGL反应体系：含0. 2%聚半乳 糖醛酸（底物）的甘氨酸-NaOH 缓冲液（0· 2mol · L \ 0· 44mmol · L 1的 CaCl 2, pH9. 4) 2mL， 待测样品20 μ L，无活性的酶液为空白对照。PGL反应条件为：将反应体系置于45°C下水浴 15min，用3mL磷酸溶液（0· 03mol · L 4终止反应，在235nm处测定吸光度值。
[0019] 实施例1 :突变菌株的获得
[0020] 采用PCR扩增或者化学合成的方法，得到氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的碱性 果胶酶基因，然后将基因连接到pET-22b (+)，再转化到大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)中，筛 选，正确的转化子命名为重组菌E. coli BL21 (DE3) (pET-22b(+)/PGL-Sl-l)。
[0021] 实施例2:突变株的验证
[0022] 种子培养：将重组菌E. coli BL21 (DE3) (pET-22b(+)/PGL-Sl-l)从甘油管中取适 量接种于1^培养基中（10(^8*1^1氨苄青霉素，2%葡萄糖），装液量为2〇1111725〇111匕37°(：， 200r · min 1摇床上振荡培养10h。
[0023] 摇瓶发酵：将培养l〇h的种子液以3 % (V/V)的接种量接入发酵培养基 丁8(10(^8.11^1氨苄青霉素）中，装液量为2〇1111725〇1^，37°(：，20(^.1^11 1培养至菌体浓 度0D600 = 0. 6,加入终浓度0. 04mM IPTG进行诱导，30°C下诱导48h。
[0024] 实施例3 :碱性果胶酶的纯化
[0025] 将重组菌发酵液8000r/min离心20min，取上清液，加硫酸铵进行梯度盐析，低温 离心收集30~50%硫酸铵沉淀部分，将盐析沉淀的酶溶解在甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液 (pH7. 5)中，用20mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液透析处理24h。离心所得上清液经阳 离子交换层析进行进一步分离纯化。
[0026] 实施例4 :碱性果胶酶纯酶液比酶活及半衰期测定
[0027] 将纯化后的碱性果胶酶稀释，按照上述方法测定酶活，用BSA蛋白浓度测定试剂 盒测定蛋白浓度，出发PGL-S1比酶活为458. 52±22. 9U/mg，而突变体PGL-S1-1比酶活高达 2621. 16±30U/mg。
[0028] 此外，本发明还比较了将PGL-S1中双亲短肽进行不同程度截短得到的突变体 的比酶活，结果显示，与PGL-S1-1相比，截短4个氨基酸，即短肽变为（AEAEAKAKAEAE或 AKAKAEAEAKAK)时，比酶活几乎没有变化；短肽截短只剩下4个氨基酸（即AEAE、AKAK或 AEAK)时，比酶活下降至没有连接短肽的最原始的碱性果胶酶比酶活。
【主权项】
1. 一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是SEQ IDNO. 1所示的序列。2. 根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的核苷酸序列是SEQID NO. 2所示的序列。3. 根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是将原有融合蛋白的短肽 进行有序截短表达。4. 编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。5. 含有权利要求1所述的突变体基因的表达载体。6. 权利要求1或2所述突变体在食品、纺织或造纸方面的应用。7. 表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。8. 根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿 主、pET-22b(+)为载体，表达碱性果胶酶突变体。9. 权利要求7或8所述基因工程菌在发酵生产碱性果胶酶方面的应用。10. 权利要求7或8所述基因工程菌在食品、纺织或造纸方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体，属于酶工程领域。相对于现有的突变体PGL-S1而言，本发明的突变体PGL-S1-1的比酶活提高了5.7倍。本发明的碱性果胶酶可在碱性条件下催化通过反式消去作用聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键裂解，广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。
【IPC分类】A23L33/18, C12N1/21, C12N9/88, C12N15/60, C12R1/19
【公开号】CN105316311
【申请号】CN201510848522
【发明人】刘松, 陈坚, 堵国成, 赵伟欣
【申请人】江南大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月27日