一条可与环丙沙星特异结合的核酸适配体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一条可与环丙沙星特异结合的核酸适配体及其应用，属于生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 核酸适配体是一段脱氧核糖核酸或者核糖核酸序列。通常是利用体外筛选技 术一指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichmentSELEX)，从相应的分子文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体能与多种目标 物质高特异性、高选择性地结合，其结合靶标包括病毒、蛋白质、小分子药物，甚至是一些重 金属离子等等，因此核酸适配体技术在生物传感器领域被广泛应用。由于核酸适配体与目 标物质发生特异性结合时，核酸适配体自身的构型会随之发生变化，因此目前很多研究者 将核酸适配体与电化学检测方法相结合，以实现检测仪器的轻便化，以达到低成本快速检 测的目的。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一条可与环丙沙星特异结合的核酸适配体及 其应用，该核酸适配体能够特异结合环丙沙星，实现对环丙沙星进行快速定性和定量检测。
[0004] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是提供一条可与环丙沙星特异结合 的核酸适配体，所述的核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0005] 所述的核酸适配体为人工合成或PCR扩增后单链化获得。
[0006] 同时，还可以对所述的核酸适配体进行延长和修饰，修饰材料包括但不局限于纳 米物质、荧光物质、相关酶类材料、生物素及特定用途的蛋白质。
[0007] 将所述核酸适配体用于环丙沙星的检测，其中包括但不局限于酶联免疫反应、放 射免疫测定、western blot检测、荧光方法检测及产品。
[0008] 本发明所采用的技术方案还在于提供一条可与环丙沙星特异结合的核酸适配体 在用于对环丙沙星进行定量和定性检测中的应用。
[0009] 本发明有益效果
[0010] (1)本发明借助指数富集的配体筛选系统，利用人工偶联的环丙沙星磁珠进行结 合筛选，再经过PCR扩增结合的核酸序列；经过多轮的富集筛选，最终得到可特异结合环丙 沙星的核酸适配体；经过人工合成序列检测，该核酸适配体可特异结合环丙沙星，其检测限 达 10. 18ng/ml。
[0011] (2)常规抗体一旦筛选完成，将不能进行特定的改造；本发明的核酸适配体可由 商业公司合成或者由PCR扩增获得，可以进行定点改造，更易人工合成，也更易标记，成本 极其低廉。
[0012] (3)本发明的核酸适配体能够与环丙沙星特异性结合，但与喹诺酮类其它药物交 叉反应性低于10%，与其它药物不存在交叉反应。
[0013] (4)利用本发明的核酸适配体能够快速建立检测环丙沙星药物的检测方法，通过 相应检测标定物的偶联，可进彳丁环丙沙星的快速定性和定量检测。
【附图说明】
[0014] 以下结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0015] 图1为本发明核酸适配体的空间结构预测图。
[0016] 图2为本发明筛选过程的检测结果。
[0017] 图3为本发明参照ELISA方法建立的标准曲线。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0019] 实施例1借助环丙沙星磁珠的指数富集筛选
[0020] 1、随机核酸库及引物的设计
[0021] 随机核酸库设计原则是，在两端分别加上20nt的固定序列，用于进行后续的扩 增，中间40nt的序列为随机序列。在合成引物的同时合成生物素化P2以备筛选鉴定。整 个随机核酸库和引物的修饰和合成由上海生工完成，具体如下：
[0022] 随机核酸库：5' -TTGACTTGCCACTGACTACC-N40-GAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3'
[0023] 上游引物 P1 :5' -TTGACTTGCCACTGACTACC-3'
[0024] 下游引物 P2 :5' -GATGACGACCGACTGACTTC-3'
[0025] 2、PCR扩增及单链次库的制备
[0026] 以随机核酸库作为模板，进行PCR扩增，具体如下：
[0027] PCR 反应体系为：模板 0· ΙμL，Ρ12·0μ1，Ρ22·0μ1，Premix Taq 25μ1，加水至 50 μ l〇
[0028] PCR反应条件为：95°C预变性 5min ;94°C变性 30s ;61. 0°C退火 30s ;72°C延伸 30s ; 循环；最后72°C延伸3min。循环扩增轮数依据每轮鉴定的扩增效果而定，以能扩增到目的 条带的最少循环次数为准。
[0029] 3、筛选过程
[0030] 第一轮筛选：
[0031] (1)将人工合成的随机核酸库稀释至10mM，加入到环丙沙星磁珠中，37°C条件下 孵育30min，然后于磁力架上清洗3次，再用10mM NaOH洗脱，并将洗脱液中和至中性；
[0032] (2)以洗脱液为模板进行PCR扩增，PCR反应体系和条件同步骤2,将PCR扩增产 物纯化并单链化处理，得到单链次库，以进行下一轮结合。
[0033] 第二轮筛选：
[0034] 将步骤（2)的单链次库与环丙沙星磁珠混合，重复第一轮筛选的步骤，得到第二 轮筛选的单链次库。
[0035] 第三轮至第十轮筛选：
[0036] 参照上述步骤，直至得到第十轮筛选的单链次库（核酸适配体）。
[0037] 4、筛选结果的鉴定
[0038] 本发明核酸适配体的检测方法是以CIP-Mag偶联物代替CIP-BSA偶联物，以筛选 的生物素化核酸适配体代替抗体来进行类似ELISA操作，具体方法步骤为：
[0039] (1)取CIP-Mag偶联物1 μ 1，用SHMCK液清洗3次，加入浓度1 % BSA 100 μ 1，室 温下混合30min，然后用SHMCK液清洗3次；
[0040] (2)加入单链化的生物素化核酸适配体，室温下混合30min，置磁力架上清洗3 次；
[0041] (3)加入1000倍稀释的HRP标记亲和素50 μ 1，室温下混合30min，置磁力架上清 洗3次；
[0042] (4)加入100 μ 1 TMB显色液，室温下混合lOmin ;
[0043] (5)加入50 μ 1 2M硫酸终止反应，置磁力架上分离上清到酶标孔中，测0D450值 (结果见图2)。
[0044] 图2结果表明，随着筛选轮数的增加，筛选结果的亲和力逐步增加。
[0045] 实施例2依据类ELISA方法标准曲线的建立
[0046] 参照实施例1中类似的ELISA操作，建立标准曲线，其方法步骤为：
[0047] (1)取CIP-Mag偶合物1 μ 1，用SHMCK液清洗3次，加入浓度1 % BSA 100 μ 1，室 温下混合30min，然后同法清洗三次；
[0048] (2)加入单链化的生物素化核酸适配体和相应不同浓度的环丙沙星标准品（或检 测样品），室温下混合30min，置磁力架上清洗3次；
[0049] (3)加入1000倍稀释的HRP标记亲和素50 μ 1，室温下混合30min，置磁力架上清 洗3次；
[0050] (4)加入100 μ 1 TMB显色液，室温下混合lOmin ;
[0051] (5)加入50 μ 1 2M硫酸终止反应，置磁力架上分离上清到酶标孔中，测0D450值。
[0052] 标准曲线绘制：以环丙沙星的浓度对数值为X轴，以选定浓度的吸光值/阳性值的 强光值的百分率为Υ轴，绘制各个浓度的点，并计算其标准曲线方程（见图3)。
【主权项】
1. 一条可与环丙沙星特异结合的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体的核苷 酸序列如SEQIDNO. 1所示。2. 根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体为人工合成或 PCR扩增后单链化获得。3. 根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，还可以对所述的核酸适配体进行 延长和修饰，修饰材料包括但不局限于纳米物质、荧光物质、相关酶类材料、生物素及特定 用途的蛋白质。4. 根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，将所述核酸适配体用于环丙沙星 的检测，其中包括但不局限于酶联免疫反应、放射免疫测定、westernblot检测、荧光方法 检测及产品。5. 根据权利要求1-4任一项所述的核酸适配体在用于对环丙沙星进行定量和定性检 测中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一条可与环丙沙星特异结合的核酸适配体及其应用，所述的核酸适配体的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明借助指数富集的配体筛选系统，利用人工偶联的环丙沙星磁珠进行结合筛选，再经过PCR扩增结合的核酸序列；经过多轮的富集筛选，最终得到可特异结合环丙沙星的核酸适配体；经过人工合成序列检测，此序列可特异结合环丙沙星，其检测限达10.18ng/ml。本发明的核酸适配体能够与环丙沙星特异性结合，但与喹诺酮类其它药物交叉反应性低于10％。利用本发明的核酸适配体能够快速建立检测环丙沙星药物的检测方法，通过相应检测标定物的偶联，可进行环丙沙星的快速定性和定量检测。
【IPC分类】C12N15/115, C12Q1/68
【公开号】CN105316342
【申请号】CN201510910813
【发明人】王方雨, 邓瑞广, 余秋颖, 胡骁飞, 邢广旭, 罗俊, 赵东, 杨继飞
【申请人】河南省农业科学院
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年12月10日