一种重组人粒细胞集落刺激因子工程菌的发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种工程菌的发酵方法，具体涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子工程菌的发酵方法。
【背景技术】
[0002]人粒细胞集落刺激因子(humangranulocyte colony stimulating factor,hG-CSF)属于造血生长因子家族。内毒素、TNF-a和IFN-γ可活化单核细胞和巨噬细胞产生G-CSF。此外，成纤维细胞、内皮细胞、星状细胞和骨髓基质细胞等在LPS、IL-1或TNF-a刺激活化后也可分泌G-CSF。某些白血病细胞以及CHu-2人口腔癌细胞、5637人膀胱癌细胞、MIAPa Ca-2胰腺癌细胞可组成性地表达G-CSF。
[0003]1986年G-CSF cDNA克隆成功，C-CSF基因全长2.5kb，包括5个外显子和4个内含子。人类有两种不同的G-CSF cDNA，分别编码含207和204氨基酸的前体蛋白，均有30个氨基酸的先导序列，成熟蛋白分子分别为177和174个氨基酸，前者除了在成熟分子N端35位处插入了 3个氨基酸外，其余的序列与174氨基酸分子相同，人G-CSF分子量为19.6kDa，PI 6.1,0-糖基化，对酸碱(pH2?10)、热以及变性剂等相对较稳定。G-CSF有5个半胱氨酸，Cys 36与Cys42，Cys74与Cys64之间形成两对二硫健，Cysl7为不配对半胱氨酸，二硫键对于维持G-CSF生物学功能是必须的因素。
[0004]人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)是一种在哺乳动物中调节粒细胞(尤其是中性粒细胞)成熟与生长的造血生长因子。它通过刺激粒细胞巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)向粒细胞集落形成单位(CFU-G)的分化和成熟，动员成熟中性粒细胞向外周血的释放，从而促进中性粒细胞的生长。在临床上用来治疗各种原因引起的中性粒细胞减少症，有很大的经济意义和社会意义。
[0005]hG-CSF的天然来源有限，产量甚微，还不能满足临床应用的需要。利用基因工程技术生产是获取大量hG-CSF的一条途径。天然hG-CSF虽是一种糖蛋白，但文献报导，未经糖基化和利用大肠杆菌表达的重组hG-CSF具有与天然hG-CSF同样的生物活性。
[0006]大肠杆菌因容易培养、遗传背景清晰、生长周期短，并能实现目的基因的高效表达，目前已成为应用最广泛的异源蛋白的原核表达系统。重组大肠杆菌细胞高密度培养是获得高外源蛋白产率的一种重要策略，能够在单位时间、单位体积的条件下获得更高的外源蛋白产率。在重组大肠杆菌的高密度培养过程中，由于大多采用的是胞内包涵体表达形式，重组异源蛋白产物的宏观合成产量取决于最高的外源基因表达水平以及菌体密度。从理论上说，在维持外源基因表达水平不变的前提下，提高工程菌的发酵密度可以大幅度提高产量，降低成本。
[0007]重组大肠杆菌的高密度发酵技术在生产实践中得到了广泛应用，并且取得了令人惊喜的成果。但是在该技术实际应用中还存在许多需要解决的问题。其中最为严重的就是培养过程中菌体过早地衰老、自溶和外源基因不能充分表达、比活性较低，这主要是细菌产生的有害的代谢废物对重组菌的抑制作用。乙酸是大肠杆菌的主要副产物，它对细菌生长和产物的表达都有抑制作用。
[0008]大肠杆菌在过量葡萄糖或缺氧的条件下会发生“葡萄糖效应”，积累大量有机酸而影响重组菌的生长和外源蛋白的有效表达。因此在大肠杆菌高密度发酵中，合理流加碳源使葡萄糖效应降低，是成功的关键。
[0009]因此，对于重组人粒细胞集落刺激因子工程菌的发酵方法存在进一步的改进和优化需求，这也是该技术领域内的研究热点和重点之一，更是本发明得以完成的动力和出发点所在。
【发明内容】
[0010]针对重组人粒细胞集落刺激因子重组工程菌在发酵过程中存在表达量低、最终菌体密度低等问题，本发明人在进行了大量的深入研究之后，提供了一种能够工业化生产的重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，本发明能够显著提高最终菌体密度和外源蛋白表达量，且设备要求简单。
[0011]本发明通过以下技术方案实现，一种重组人粒细胞集落刺激因子工程菌(PBVQG8/MM294)的发酵方法，包括如下步骤:
[0012]步骤一，从液氮罐中取出pBVQG8/MM294工程菌种子进行复苏；
[0013]步骤二，将复苏的种子接种到含LB培养基的摇瓶中进行一次扩增；
[0014]步骤三，以体积比2%的接种量，接入数个含LB培养基的摇瓶中，进行二次扩增，待摇瓶中的菌液内0D6。。值超过1，作为种子液接种入发酵罐，质量体积比50%的葡萄糖溶液与发酵罐控制pH的酸栗连接，氨水与发酵罐控制pH的碱栗连接；
[0015]步骤四，种子液接种入所述发酵罐后，设定温度控制为28 °C，溶氧控制20%，pH控制为7.2，开始发酵；随着发酵的进行，工程菌利用葡萄糖进行生长，并产酸，发酵罐自动补入氨水中和；随着葡萄糖的利用，罐内葡萄糖浓度趋于0，此时工程菌只能利用氮源进行生长，并且产碱，罐内pH值会缓慢上升，发酵罐自动开启酸栗，补入葡萄糖；工程菌再次利用葡萄糖生长，并产酸，降低罐内的pH值；如此重复循环，工程菌在罐内不断生长，实现高密度，同时避免罐内存在过量葡萄糖发生“葡萄糖效应”而积累大量有机酸影响重组菌的生长和外源蛋白的有效表达；
[0016]步骤五，当发酵罐内0D6。。值达到70?80之间时，提高发酵罐的控制温度至42 °C，使工程菌开始表达外源重组蛋白rhG-CSF，表达时间维持4-6小时，获得发酵液。
[0017]优选的，步骤三中，发酵罐中的培养基为蛋白胨12g/L、酵母膏24g/L、甘油4ml/L、KH2P04 2.31g/L、K2HP04 1 2.54g/L、葡萄糖 2g/L、MgS04 0.2g/L、微量元素 3ml/L。
[0018]优选的，在步骤五之后，还包括以下步骤:将获得的发酵液进行离心收集菌体；菌体放入-20°C进行冻融；冻融后的菌体放入裂解液中混匀，进行超声破碎；破碎后的混悬液进行离心收集包涵体。
[0019]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:本发明提供的发酵方法采用pH反馈补料的方法来进行重组人粒细胞集落刺激因子工程菌(PBVQG8/MM294)的高密度发酵。通过pH值的变化，推测细菌的生长状态，调节流加葡萄糖速度，调节pH为恒定值，简化了补料的操作方式，rhG-CSF的表达量大约等于35%，最终菌体湿重超过了 100克/L ;而且本发明的发酵工艺制备的包涵体经复性和精纯制备成rhG-CSF原液，原液电泳纯度达到99%以上，RP-HPLC的纯度达到98%以上，比活性6.6X 107IU/mg，因此，可用于制备重组人粒细胞集落刺激因子。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0021]实施例1:菌种复苏与种子液制备
[0022]从液氮罐中取出含有pBVQG8/MM294菌种的冻存管一支，迅速放入28°C水浴中，不停搅拌，使其溶解；
[0023]在洁净超净台或者生物安全柜中，打开冻存管，以无菌操作的方式，将冻存管中的菌种移入含100ml LB培养基的1L摇瓶中，将摇瓶放入摇床内，28°C，180rmp下培养7?8小时；
[0024]以体积比2%的接种量，接中10个含300ml LB培养基的1L摇瓶中，将摇瓶放入摇床内，28°C，180rmp下培养过夜。
[0025]实施例2:pBVQG8/MM294工程菌的发酵
[0026]50L发酵罐内加入培养基，发酵罐中的培养基为蛋白胨12g/L、酵母膏24g/L、甘油4ml/L、KH2P04 2.31g/L、Κ2ΗΡ04 1 2.54g/L、葡萄糖 2g/L、MgS04 0.2g/L、微量元素 3ml/L，按照发酵罐说明书进行原位灭菌；
[0027]将种子液接入50L发酵罐，温度控制28°C，pH7.2，溶氧质量比20 %，起始搅拌转速为lOOrpm，通气量10L/min ;酸栗连接质量体积比50%的葡萄糖，碱栗连接氨水；开始发酵，发酵过程中检测发酵液的0D_值，0D600值到达70，升温至42°C，进行rhG-CSF蛋白的表达，外源蛋白表达维持6小时，对发酵液进行外源蛋白表达量测定，外源蛋白表达量为36.4% ο
[0028]实施例3:rhG-CSF工程菌收集与包涵体获得
[0029]rhG-CSF经高密度发酵后，离心收集湿菌体，离心转速为8000rpm ;收集后的菌体重量5125克；再放置于_20°C，冻融一次；取400克冻融后的菌体，按体积比1:10比例混悬于裂解液中(20mmol/L Tris-HCl EDTA lmmol/L DTT 1.5g/L，pH 8.0)，混合成均一的悬液后，使用大功率超声波细胞破碎仪对混悬液进行破菌及匀浆处理；10000g离心收集包涵体60克。
[0030]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
【主权项】
1.一种重组人粒细胞集落刺激因子工程菌(PBVQG8/MM294)的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一，从液氮罐中取出PBVQG8/MM294工程菌种子进行复苏； 步骤二，将复苏的种子接种到含LB培养基的摇瓶中进行一次扩增； 步骤三，以体积比2%的接种量，接入数个含LB培养基的摇瓶中，进行二次扩增，待摇瓶中的菌液内0D6。。值超过1，作为种子液接种入发酵罐，质量体积比50%的葡萄糖溶液与发酵罐控制pH的酸栗连接，氨水与发酵罐控制pH的碱栗连接； 步骤四，种子液接种入所述发酵罐后，设定温度控制为28°C，溶氧控制20%，pH控制为7.2，开始发酵；随着发酵的进行，工程菌利用葡萄糖进行生长，并产酸，发酵罐自动补入氨水中和；随着葡萄糖的利用，罐内葡萄糖浓度趋于0，此时工程菌只能利用氮源进行生长，并且产碱，罐内pH值会缓慢上升，发酵罐自动开启酸栗，补入葡萄糖；工程菌再次利用葡萄糖生长，并产酸，降低罐内的pH值；如此重复循环，工程菌在罐内不断生长，实现高密度，同时避免罐内存在过量葡萄糖发生“葡萄糖效应”而积累大量有机酸影响重组菌的生长和外源蛋白的有效表达； 步骤五，当发酵罐内OD_值达到70?80之间时，提高发酵罐的控制温度至42°C，使工程菌开始表达外源重组蛋白rhG-CSF，表达时间维持4-6小时，获得发酵液。2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤三中，发酵罐中的培养基为蛋白胨12g/L、酵母膏 24g/L、甘油 4ml/L、KH2P042.31g/L、K2HP0412.54g/L、葡萄糖 2g/L、MgS040.2g/L、微量元素3ml/L。3.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，在步骤五之后，还包括以下步骤:将获得的发酵液进行离心收集菌体；菌体放入_20°C进行冻融；冻融后的菌体放入裂解液中混匀，进行超声破碎；破碎后的混悬液进行离心收集包涵体。
【专利摘要】本发明涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子工程菌的发酵方法，包括如下步骤：菌种复苏；种子液制备；分批补料高密度发酵。本发明提供的发酵方法具有发酵工艺简单、最终菌体密度高、外源蛋白表达高和稳定性好的优点，可用于制备重组人粒细胞集落刺激因子。
【IPC分类】C12R1/19, C12P21/02
【公开号】CN105316379
【申请号】CN201510474655
【发明人】傅晖, 岑仡, 郑剑, 李文利, 于红君, 薛亮, 匡瑾瑾
【申请人】上海三维生物技术有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年8月5日