漂珠固定化漆酶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境保护技术领域，具体涉及一种漂珠固定化漆酶及其制备方法。
【背景技术】
[0002]漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是含有四个铜离子的多酚氧化酶，铜离子处于其活性部位，在氧气参与下催化氧化有机污染物。漆酶主要分布在一些高等植物如漆树及一些真菌如白腐菌中。漆酶具有较好的底物专一性和稳定性，因而在废水处理、生物漂白和生物传感器构建等方面具有重要的应用前景。由于漆酶易溶于水，使用后不易回收再利用，限制了其在实际生产中的应用。
[0003]固定化漆酶是指将水溶性漆酶以物理或化学的方法固定在有机或无机的载体上，形成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物。固定化酶与游离酶相比具有很多优点，它能够延长酶的使用寿命，提高酶的稳定性及其对环境的适应性，因而能够克服直接使用游离酶的不足。
[0004]固定化漆酶的制备主要有吸附法、包埋法、交联结合法和共价键键合法。吸附法是指将酶液与石墨、碳纤维、过渡金属或其氧化物等活泼载体接触，使酶通过分子间相互作用力吸附在载体上的方法。物理吸附的优点在于其操作简单、造价低廉、固定化酶初始活性较高，但固定化酶容易因酶和载体结合力不强，脱落而失活。包埋法是将漆酶物理包埋于高聚物网格内或微囊内的方法，一般反应条件温和，对酶自身的结构改变很少，因此酶活性损失较小，但包埋法处理的固定化酶仅适合于底物和产物均为小分子的催化反应，对有大分子参与的催化反应过程较差。交联法是借助双功能团或多功能团试剂，使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构固定化酶的方法，由于交联法反应条件剧烈，单独使用交联法固定化漆酶的效果不佳。共价键键合法是指酶分子上的非活性官能团与载体上的活化基团反应，形成稳定的共价键的方法，使酶与载体形成牢固结合，不易发生酶的脱落，是目前酶固定化研究中最为活跃的领域，但目前共价键法存在反应条件较为苛刻，加工工艺较长，固定化效率较低的缺陷，很难工业化生产。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有共价键键和法的缺点，提供一种操作简单，反应条件温和的固定化漆酶及其制备方法，该固定化漆酶可以方便、高效率的去除水中的染料等有机污染物。
[0006]本发明的一种漂珠固定化漆酶的制备方法，其特征按如下步骤实施:
[0007](1)胺基改性漂珠的制备:
[0008]粉煤灰漂珠经200目和250目的不锈钢筛子筛分，取粒径为200-250目之间的颗粒。放入2mol/L的盐酸溶液中浸泡洗涤60min，水洗去除酸液后，放入烘箱烘干，备用。取经过酸洗的漂珠放入异丙醇与去离子水的混合溶液中，搅拌形成悬浮液，在室温条件下滴加胺基硅烷的醇水溶液，滴加完毕后，继续反应12-24h。反应结束后，过滤分离得到固体，用醇水混合溶液洗涤颗粒表面，去掉未反应的胺基硅烷，得到的固体即为胺基改性漂珠。
[0009](2)漂珠固定化漆酶的制备:
[0010]在烧瓶中加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH = 6.0)、胺基改性漂珠、1-(3- 二甲胺基丙基)-3_乙基碳二亚胺和漆酶溶液，在室温条件下搅拌反应12-24h，反应结束后过滤分离，用缓冲液反复洗涤，直至上清液中检测不到蛋白质。得到的固体颗粒即为漂珠固定化漆酶，保存于4°C的冰箱中备用。
[0011]上述所述(1)中胺基硅烷可以是γ-胺丙基三乙氧基硅烷、γ-胺丙基三甲氧基硅烷、Ν-(β-氨乙基)-γ-胺丙基三乙氧基硅烷、苯胺基甲基三乙氧基硅烷、苯胺基甲基三甲氧基硅烷中的一种或二种混合物。
[0012]上述所述(1)中漂珠与胺基硅烷的质量比为(8-2): 1。
[0013]上述所述(2)中漆酶溶液为将漆酶溶解于0.lmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH = 6.0)，质量浓度为20g/L。
[0014]上述所述(2)中胺基改性漂珠，1-(3- 二甲胺基丙基)-3_乙基碳二亚胺和漆酶溶液的质量比为10: (1-3): (20-40)。
[0015]本发明的漂珠固定化漆酶可以明显提高漆酶的稳定性和重复利用率，可以直接用于含有染料等有机废水中。由于漂珠具有良好的机械性能和漂浮性能，使用过程中适当的机械搅拌作用可形成悬浮体系，催化反应结束后，撤掉机械搅拌作用，固定化漆酶即可漂浮在溶液表层，极易进行机械分离。
[0016]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
[0018]粉煤灰漂珠经200目和250目的不锈钢筛子筛分，取粒径为200-250目之间的颗粒。将20g漂珠放入2mol/L的盐酸溶液100mL中浸泡洗涤60min，水洗去除酸液后，放入烘箱烘干，备用。取酸洗漂珠5g放入50mL异丙醇与去离子水的混合溶液(9: 1)中，开启磁力搅拌，使之形成悬浮液。在室温条件下滴加10g质量浓度为10%的γ-胺丙基三乙基硅烷醇水溶液(异丙醇:去离子水=9: 1)，滴加完毕后，继续反应12h。反应结束后，过滤分离得到的固体，用醇水混合溶液洗涤颗粒表面3-5次，去掉为未应的胺基硅烷，得到的固体即为胺基改性漂珠。
[0019]在烧瓶中加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH = 6.0) 50mL，胺基改性漂珠5g、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺lg、漆酶溶液25mL，在室温条件下搅拌反应15h，反应结束后过滤分离，用缓冲液反复洗涤，直至上清液中检测不到蛋白质。得到的固体颗粒即为漂珠固定化漆酶，保存于4°C的冰箱中备用。
[0020]将上述漂珠固定化漆酶1 g，加入含有150mg/L的活性蓝KN-R或活性蓝X-BR的100mL染料废水中，进行脱色研究，活性蓝KN-R的脱色率达到86 %，而活性蓝X-BR高达92%。
[0021]实施例2
[0022]取酸洗漂珠5g放入50mL异丙醇与去离子水的混合溶液(4: 1)中，开启磁力搅拌，使之形成悬浮液。在室温条件下滴加15g质量浓度为10%的苯胺基甲基三乙氧基硅烷的醇水溶液(异丙醇:去离子水=4: 1)，滴加完毕后，继续反应15h。反应结束后，过滤分离得到的固体，用醇水混合溶液洗涤颗粒表面3-5次，去掉未反应的胺基硅烷，得到的固体即为胺基改性漂珠。
[0023]在烧瓶中加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH = 6.0) 50mL，胺基改性漂珠5g、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺0.8g、漆酶溶液20mL，在室温条件下搅拌反应15h，反应结束后过滤分离，用缓冲液反复洗涤，直至上清液中检测不到蛋白质。得到的固体颗粒即为漂珠固定化漆酶，保存于4°C的冰箱中备用。
[0024]将上述漂珠固定化漆酶1 g，加入含有150mg/L的活性蓝KN-R或活性蓝X-BR的100mL染料废水中，进行脱色研究，活性蓝KN-R的脱色率达到83 %，而活性蓝X-BR高达90%。
[0025]实施例3
[0026]取酸洗漂珠5g放入50mL异丙醇与去离子水的混合溶液(9: 1)中，开启磁力搅拌，使之形成悬浮液。在室温条件下滴加15g质量浓度为10%的γ-胺丙基三乙氧基硅烷醇水溶液(异丙醇:去离子水=9: 1)，滴加完毕后，继续反应15h。反应结束后，过滤分离得到的固体，用醇水混合溶液洗涤颗粒表面3-5次，去掉未反应的胺基硅烷，得到的固体即为胺基改性漂珠。
[0027]在烧瓶中加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH = 6.0) 50mL，胺基改性漂珠5g、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺1.2g、漆酶溶液30mL，在室温条件下搅拌反应15h，反应结束后过滤分离，用缓冲液反复洗涤，直至上清液中检测不到蛋白质。得到的固体颗粒即为漂珠固定化漆酶，保存于4°C的冰箱中备用。
[0028]将上述漂珠固定化漆酶1 g，加入含有150mg/L的活性蓝KN-R或活性蓝X-BR的100mL染料废水中，进行脱色研究，活性蓝KN-R的脱色率达到88 %，而活性蓝X-BR高达93%。
[0029]实施例4
[0030]取酸洗漂珠5g放入50mL异丙醇与去离子水的混合溶液(9: 1)中，开启磁力搅拌，使之形成悬浮液。在室温条件下滴加5g的γ-胺丙基三乙氧基硅烷(质量浓度10% )的醇水溶液(异丙醇:去离子水=9: 1)和3g的Ν-(β-氨乙基)-丫_胺丙基三乙氧基硅烷(质量浓度10% )的醇水溶液(异丙醇:去离子水=4: 1)，滴加完毕后，继续反应15h。反应结束后，过滤分离得到的固体，用醇水混合溶液洗涤颗粒表面3-5次，去掉未反应的胺基硅烷，得到的固体即为胺基改性漂珠。
[0031]在烧瓶中加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH = 6.0) 50mL，胺基改性漂珠微粒5g、1-(3- 二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺1.5g、漆酶溶液35mL，在室温条件下搅拌反应15h，反应结束后过滤分离，用缓冲液反复洗涤，直至上清液中检测不到蛋白质。得到的固体颗粒即为漂珠固定化漆酶，保存于4 V的冰箱中备用。
[0032]将上述漂珠固定化漆酶1 g，加入含有150mg/L的活性蓝KN-R或活性蓝X-BR的100mL染料废水中，进行脱色研究，活性蓝KN-R的脱色率达到90 %，而活性蓝X-BR高达94%。
【主权项】
1.一种漂珠固定化漆酶及其制备方法，其特征制备方法包括: (1)胺基改性漂珠制备:酸洗漂珠微粒放入异丙醇与去离子水的混合溶液中，在室温条件下与胺基硅烷反应12-24h，过滤分离得胺基改性漂珠； (2)漂珠固定化漆酶的制备:胺基改性漂珠、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺和漆酶溶液加入到磷酸盐缓冲溶液中，室温条件下反应12-24h，过滤分离，得固体漂珠固定化漆酶。2.根据权利要求1所述的漂珠固定化漆酶及其制备方法，其特征在于:(1)中漂珠与胺基硅烷的质量比为(8-2): 1 ; (2)中胺基改性漂珠、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺和漆酶溶液的质量比为10: (1-3): (20-40)。
【专利摘要】本发明涉及一种漂珠固定化漆酶及其制备方法，首先利用漂珠与胺基硅烷反应，在漂珠的表面进行胺基化改性，合成胺基改性漂珠。随后以1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺为交联剂将漆酶固定在胺基改性漂珠表面，得固体漂珠固定化漆酶。该固定化漆酶用于含有染料的废水中，可以有效的清除染料的颜色。
【IPC分类】C12N11/14
【公开号】CN105349520
【申请号】CN201510872957
【发明人】孙德帅, 姜鹏, 张中一, 张晓东, 方龙
【申请人】青岛大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月26日