一种提高脱落酸固体发酵产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提高脱落酸固体发酵产量的方法，属于发酵工程领域。
【背景技术】
[0002]脱落酸是植物五大激素之一，在植物生长发育中起多方面作用:如调节气孔开闭，抑制种子发芽，控制胚胎和种子发育成熟，涉及抗逆作用如脱水，干旱，盐胁迫，低温，病虫害和机械创伤等环境因子应答。在农业中，可用于提高作物的抗旱、抗寒、抗盐能力，在其应用领域已经有大量专利报道，如专利CN104671979A公开了一种含脱落酸的拌种剂，可提高东农冬麦I号抗寒能力；专利CN101199284公开了一种含脱落酸的仁用杏树花果防冻剂；专利CN1229015C公开了一种含脱落酸的花期延长剂等。
[0003]脱落酸的生产方法主要可以分为三类:(I)从植物中提取；(2)化学合成；(3)微生物发酵法。其中植物中提取的方法因植物中含量极低，难以大量获得，成本过高而无应用价值。人工合成脱落酸为多种光学异构体的混合物，拆分困难，活性远小于天然型的脱落酸，售价昂贵，限制了其应用。而微生物发酵法是近年来兴起的天然脱落酸生产方法，已经在工业上推广应用。
[0004]微生物发酵法生产脱落酸，主要使用的是真菌，如灰葡萄孢霉菌(汉cinerea),因为该菌发酵产量比其他微生物高，这在文献中已经有较详细的报道(陆丽珍等，氨基酸和生物资源2011，33 (2):23~26)。为提高其发酵产量，人们主要对其发酵液成分、营养物质、添加前体等进行了研究。例如:日本专利JP 5836393报道了在C rosicWa液体发酵培养基中添加鸟嘌呤，可使发酵产量提高；但由于鸟嘌呤价格较昂贵，在生产过程中成本较高。日本专利JP 0260590报道了在汉cherea液体发酵培养基中添加柑橘干果皮提取物，可提高发酵产量，但由于柑橘果皮中含有抑制真菌生长的物质，且其含量受到柑橘种类、产地等因素的影响，在发酵中较难控制其添加量。
[0005]国内专利CN1182798A公开了一种采用三级发酵方法，在第三级发酵中采用连续流加补料出料以及菌种固定化，并添加关键底物如咪唑、吗啉、吡啶及其衍生物、乙酰胺、乙酸胺、甲羟戊酸等中的任一种，使脱落酸的产量可达到1.2克/升发酵液。专利CN101041837A公开了一种通过在发酵过程中流加肌醇解除葡萄糖阻遏的工艺来提高脱落酸的产量。
[0006]专利CN 102399827 A则通过在发酵过程中流加乙酰辅酶A作为菌株合成脱落酸的前体物质，同时，添加生物表面活性剂吐温-20改善发酵液溶氧状况来制备天然脱落酸的方法，可以提高脱落酸的发酵产量。
[0007]但现有主要集中在液体发酵领域，对固体发酵报道较少。相比于液体发酵，固体发酵具有耗水量少、能耗低、可充分利用农业废弃物(如麸皮、秸杆)等优点；此外，固体发酵产物直接使用有机溶剂浸提其中的脱落酸，经后续工艺减压浓缩后回收有机溶剂，几乎无废水排放，废渣则可用作含氮肥料或制沼气，减少对环境的污染。本专利报道了一种添加柠檬酸或柠檬酸盐提高固体发酵产量的方法，可使发酵产量大幅度提高，降低生产成本。
【发明内容】
[0008]本发明公开了一种提高脱落酸固体发酵产量的方法，包括斜面培养、种子培养及固体发酵工艺，在发酵过程中添加柠檬酸及其盐类的一种或者两种以上的组合，从而提高灰葡萄孢霉菌固体发酵产天然脱落酸的产量。与现有液体发酵技术相比，本发明所用固体发酵工艺可减少水资源的损耗，并可以促进农业副产物如秸杆的再利用。另外，本发明中所用的发酵促进剂价格低廉，可显著提高脱落酸固体发酵产量，与原始工艺相比发酵产量提高40.19^115.8%，脱落酸发酵产量可达3.lg/kg以上，工艺简单，便于工业应用。
[0009]本发明的目的在于提高脱落酸固体发酵产量，促进其固体发酵工艺的应用。
[0010]本发明通过以下技术方案进一步解决技术问题，整个技术方案包括以下步骤: 第一步，将灰葡萄孢霉菌进行斜面培养5-7天，培养温度24_30°C ;
第二步，经斜面培养的灰葡萄孢霉菌进行种子培养48-96小时，培养温度24-30°C ;第三步，经种子培养的灰葡萄孢霉菌进行固体发酵培养7-11天，培养温度24-30°C，培养时每千克培养基质中添加0.001-50g朽1檬酸盐，搅勾后静置培养；
第四步，发酵产物经有机溶剂提取，纯化后得到高产量的脱落酸。
[0011]上述方法中在发酵工艺中使用的菌种为灰葡萄孢霉菌As 3.4584，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0012]本发明通过以下技术方案进一步解决技术问题，所述第一步中，斜面培养基采用PDA培养基。
[0013]所述第二步中，种子培养基为PDA培养基，灭菌后在溶化状态下取20ml置于平皿中，冷却备用。在无菌条件下将约IcmXlcm斜面菌苔接种于种子平皿中，静置培养。
[0014]所述第三步中，固体发酵培养基的组成为，每千克培养基含麸皮10_150g，稻杆粉10-150g，小米 lO-lOOg，葡萄糖 5-50g，酵母粉 5-50g，蛋白胨 5_50g，CaC03 10-100g，柠檬酸或柠檬酸盐0.001-50g，余量为水。所述柠檬酸盐为柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、柠檬酸钙、柠檬酸铁、柠檬酸镁、柠檬酸锌、柠檬酸铜中的至少一种，柠檬酸盐单独在121°C灭菌25min，在发酵过程中一次或分次添加至发酵培养基中。
[0015]将生长有灰葡萄孢霉菌的种子培养基以1%-10%的接种量接种至固体发酵培养基中，搅匀后静置培养。
[0016]所述第四步中，发酵后的产物用乙醇浸泡，提取其中的脱落酸，过滤后收集提取液，浓缩至粘稠状液体，用热的乙酸乙酯溶解，冷却后结晶可得到脱落酸产品。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
菌种活化用培养基为土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA):称取新鲜土豆200 g，洗净后去皮切成小块并煮沸30 min，四层-八层纱布过滤，后加入葡萄糖20g和琼脂20 g，加热充分溶解后补水至1L，灌装试管，121°C灭菌20 min，将试管倾斜放置，冷却后制成斜面。将冻干保存的灰葡萄孢霉菌挑取到斜面上活化，26°C培养培养5天。
[0018]用无菌刮刀挑取活化后的菌苔约IcmX lcm，铺于种子PDA平皿中央，置于26°C下静置培养3天，至菌丝铺满整个平皿。
[0019]固体发酵培养基组成为:每千克培养基含麸皮50g，稻杆粉100g，小米50g，葡萄糖20g，酵母粉20g，蛋白胨10g，CaCO3 30g，余量为水，搅拌均匀后于121°C灭菌25min。将配置的发酵培养基分成两组，一组加10ml/kg的无菌水，作为空白对照；另一组将柠檬酸钠溶解配置成0.2g/ml溶液，121°C灭菌20 min，每kg培养基加10ml。然后每kg固体发酵培养基中接种20g种子培养物，无菌条件下搅拌均匀，置于灭菌托盘中，盖上八层纱布，在27°C下静置培养8天。测得柠檬酸钠组脱落酸产量为1.97g/kg，而不加发酵促进剂的对照组产量为1.21 g/kg，比对照产量提高了 62.8%。
[0020]实施例2
菌种活化及种子培养方法同实施例1。固体发酵培养基组成为:每千克培养基含麸皮100g，稻杆粉50g，小米100g，葡萄糖10g，酵母粉10g，蛋白胨10g, CaCO3 20g，余量为水，搅拌均匀后于121°C灭菌25min。将配置的发酵培养基分成两组，一组分别于0h、12h、24h、48h加2.5ml/kg的无菌水，作为空白对照；另一组将梓檬酸钱溶解配置成lmg/ml溶液，0.22Mm滤膜过滤除菌，分别于0h、12h、24h、48h分4次，各加2.5ml/kg至固体发酵培养基中。然后每kg固体发酵培养基中接种30g种子培养物，无菌条件下搅拌均匀，置于灭菌托盘中，盖上八层纱布，在27°C下静置培养8天。测得柠檬酸铵组脱落酸产量为3.10g/kg，而不加发酵促进剂的对照组产量为1.39 g/kg,比对照产量提高了 115.8%。
[0021]实施例3
菌种活化及种子培养方法同实施例1。每千克培养基含麸皮10g，稻杆粉90g，小米20g，葡萄糖20g，酵母粉40g，蛋白胨50g，CaCO3 10g,余量为水，搅拌均匀后于121°C灭菌25min。将配置的发酵培养基分成两组，一组加10ml的无菌水，作为空白对照；另一组将柠檬酸镁溶解配置成0.5g/ml溶液，121°C灭菌20 min，加10ml至固体发酵培养基中。然后每kg固体发酵培养基中接种1g种子培养物，无菌条件下搅拌均匀，置于灭菌托盘中，盖上八层纱布，在27°C下静置培养8天。测得柠檬酸铵组脱落酸产量为2.61g/kg，而不加发酵促进剂的对照组产量为1.25g/kg，比对照产量提高了 108.8%。
[0022]除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
【主权项】
1.一种提高脱落酸固体发酵产量的方法，包括以下步骤: 第一步，将灰葡萄孢霉菌进行斜面培养5-7天，培养温度24-30°C ; 第二步，经斜面培养的灰葡萄孢霉菌进行种子培养48-96小时，培养温度24-30°C ; 第三步，经种子培养的灰葡萄孢霉菌进行固体发酵培养7-11天，培养温度24-30°C，培养时每千克培养基质中添加0.001-50g朽1檬酸盐，搅勾后静置培养； 第四步，发酵产物经有机溶剂提取，纯化后得到高产量的脱落酸。2.根据权利要求1所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:所述第一步中，斜面培养基采用PDA培养基。3.根据权利要求1所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:所述第二步中，种子培养基为PDA培养基，置于平皿中静置培养。4.根据权利要求1所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:所述第三步中，固体发酵培养基的组成为，每千克培养基含麸皮10_150g，秸杆粉10-150g，小米10-100g，葡萄糖5-50g，酵母粉5-50g，蛋白胨5-50g，CaC03 1 0-100g，柠檬酸或柠檬酸盐0.001_50g，余量为水。5.根据权利要求4所述的提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:所述柠檬酸盐为柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、柠檬酸钙、柠檬酸铁、柠檬酸镁、柠檬酸锌、柠檬酸铜中的至少一种，朽1檬酸盐单独在121°C灭菌25min，在发酵过程中一次或分次添加至发酵培养基中。6.根据权利要求5所述的提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:所述柠檬酸盐的添加量为 0.001-50g/kgo7.根据权利要求1所述的提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:将生长有灰葡萄孢霉菌的种子培养基以1%-10%的接种量接种至固体发酵培养基中，搅匀后静置培养。8.根据权利要求1所述的提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:发酵后的产物用乙醇浸泡，提取其中的脱落酸，过滤后收集提取液，浓缩至粘稠状液体，用热的乙酸乙酯溶解，冷却后结晶可得到脱落酸产品。
【专利摘要】本发明涉及一种提高脱落酸固体发酵产量的方法，属于发酵工程领域。本发明的方法包括斜面培养、种子培养及固体发酵等步骤，其特点是在固体发酵过程中添加柠檬酸盐，可大幅度提高脱落酸的产量。本方法中所用发酵促进剂成本低，工艺简单，便于工业应用。
【IPC分类】C12R1/645, C12P7/42
【公开号】CN105349582
【申请号】CN201510966045
【发明人】郑珩, 劳兴珍, 余永柱
【申请人】南京广方生物科技有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月22日