一种淡水鱼静息态肌卫星细胞稳定剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物基因技术领域，具体是一种淡水鱼静息态肌卫星细胞稳定剂。
【背景技术】
[0002] 静息态肌卫星细胞位于肌膜和基底膜之间，当受到激活信号刺激时，肌卫星细胞 即被激活、增殖，并与原有的骨骼肌细胞相互融合，形成新的肌纤维细胞。静息态肌卫星细 胞（quiescentmusclesatellitecells,QMSC)形态上表现为胞质少、细胞器疏松、与相邻 肌纤维核大小相近、异染色质与常染色质的比例高和转录活性低等特点。在多种刺激因素 作用下，体内静息态肌卫星细胞的胞质发生扩张，体积增大，高尔基体、内质网、核糖体和线 粒体等细胞器变得清晰明显时，表明肌卫星细胞开始进入激活态，肌卫星细胞激活后进入 分裂、增殖期，产生成肌前体细胞（myogenicprecucells，MPCs)，并进一步分化、融合形成 肌管，再分化、融合形成新的肌细胞。目前已确定了一些在静息期、激活期及扩增期特异表 达的肌卫星细胞标志。化巧是已明确的静息态肌卫星细胞标记物，在肌卫星细胞激活期和 扩增期其表达量明显下调。激活后，肌卫星细胞分化受到诸多因子调控，如血清应答因子 (serumresponsefactor,SRF)和生肌调节因子（myogenicregulatoiTfactor,MRF)等。
[0003] 与哺乳动物不同，鱼类胚后发育过程中肌纤维不仅能增长增粗，而且通过成熟肌 纤维周围肌卫星细胞的不断激活、分化和自我更新使肌纤维不断增殖。目前体内外实验 都表明鱼类静息态肌卫星细胞很难维持稳定，敲除生肌调节因子能抑制肌卫星细胞激活分 化，但此类方法不仅花费较高、治疗繁琐，而且无法从源头上维持肌卫星细胞静息水平。因 此开发相应稳定剂是维持肌卫星细胞静息水平的新途径，本发明通过化学合成一对特异抑 制淡水鱼类血清应答因子表达的核巧酸短链，从降低肌肉血清应答因子含量方面来维持肌 卫星细胞静息水平，既为阐明维持淡水鱼类肌卫星细胞静息状态的分子调控机理，W期为 更深一步掲示鱼类肌肉胚后生长发育调控机制奠定基础，也将为我国鱼类肉质品质改良和 促进水产业优质、高效和健康发展提供重要的理论依据。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种能降低淡水鱼促肌卫星细胞激活的主要蛋白含量的 淡水鱼静息态肌卫星细胞稳定剂。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 一种淡水鱼静息态肌卫星细胞稳定剂，其成分是经过标记与化学修饰的化学合成的双 链小RNA分子，其中： 双链小RNA分子的正向序列为：5' -AAAUGUAGUAGACUAUAAGUAU-3'，如沈QIDNo. 1所 示； 双链小RNA分子的反向序列为：5' -AsUsACUUAUAGUCUACUACAsUsUsUs-Chol3'，如沈Q IDNo. 2 所示； 反向序列进行化学修饰：3'端胆固醇修饰，5'端两个硫代修饰，3'端4个硫代修饰， 反向序列全碱基甲基化修饰。
[0006] 所述的淡水鱼静息态肌卫星细胞稳定剂的用途，用于维持淡水鱼肌卫星细胞的静 息状态。
[0007] 作为本发明进一步的方案：所述的淡水鱼静息态肌卫星细胞稳定剂的用途，用于 抑制淡水鱼血清应答因子的表达。
[0008] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： (1)本发明是综合运用分子生物学、组织学和化学合成原理，对淡水鱼肌卫星细胞深入 研究基础上，研究开发的具有高效、稳定等特点的静息态肌卫星细胞稳定剂。
[0009] (2)本发明生产工艺成熟、产品质量稳定、价格合理、核屯、技术先进和易操作性，是 目前比较新型的鱼类静息态肌卫星细胞稳定剂，具有广阔的市场前景。
[0010] (3)本发明的突出优点是人工合成了维持淡水鱼肌卫星细胞静息态的新型小RNA 化合物，制作的稳定剂能够明显抑制促肌卫星细胞激活的主要蛋白含量（即抑制血清应答 因子的表达)，维持淡水鱼肌卫星细胞静息状态。
【附图说明】
[0011] 图1为稳定剂对賴鱼肌肉血清应答因子表达的影响（n=5)的柱形图； 图2为稳定剂对草鱼肌肉血清应答因子表达的影响（n=5)的柱形图； 图3为稳定剂对草鱼静息态肌卫星细胞数量的影响（n=5)的柱形图。
【具体实施方式】
[0012] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0013] 实施例1稳定剂对賴鱼肌肉血清应答因子表达的影响 通过賴鱼肌肉局部注射的方式，研究稳定剂在降低肌肉中血清应答因子的作用： W不注射任何试剂为阴性对照组，W注射憐酸盐缓冲液（PBS)为阳性对照组，W注射稳 定剂为试验组，试验组注射剂量为20μg/g体重，连续注射Ξ天，每天一次，注射完成后一 周取賴鱼背部肌肉对血清应答因子表达定量分析，具体结果如图1所示。
[0014] 由图1可知：注射稳定剂的试验组賴鱼肌肉血清应答因子表达量比阳性对照组和 阴性对照组显著降低；阳性对照组和阴性对照组的賴鱼血清应答因子表达量差异不显著； 因此，可W判断，注射稳定剂能降低賴鱼肌肉血清应答因子表达量。
[0015] 实施例2稳定剂对草鱼肌肉血清应答因子表达的影响 通过草鱼肌肉局部注射的方式，研究稳定剂在降低肌肉中血清应答因子的作用： 实验分组如实施例1，实验一周后，取草鱼背部肌肉对血清应答因子表达定量分析，具 体结果如图2所示。
[0016] 由图2可知：注射稳定剂的试验组草鱼肌肉血清应答因子表达量比阳性对照组和 阴性对照组显著降低；阳性对照组和阴性对照组草鱼血清应答因子表达量差异不显著；因 此，可W判断，注射稳定剂能降低草鱼肌肉血清应答因子表达量。
[0017] 实施例3稳定剂对草鱼静息状态肌卫星细胞数量的影响 实验分组如实施例2,实验一周后，取草鱼背部肌肉进行指标测量，具体结果如图3所 /J、- 〇
[0018] 由图3可见：与阳性对照组和阴性对照组两组相比，注射稳定剂的试验组化巧阳 性肌卫星细胞数量显著高于阳性对照组和阴性对照组；阳性对照组和阴性对照组化巧阳 性肌卫星细胞数量差异不显著。因此，可W判断，注射稳定剂能维持草鱼肌卫星细胞静息状 态。
[0019] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够W其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。
[0020] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加W描述，但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案，说明书的运种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当 将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可W经适当组合，形成本领域技术人员 可W理解的其他实施方式。
【主权项】
1. 一种淡水鱼静息态肌卫星细胞稳定剂，其特征在于，其成分是经过标记与化学修饰 的化学合成的双链小RNA分子，其中： 双链小RNA分子的正向序列为W -AAAUGUAGUAGACUAUAAGUAIKV，如SEQ IDNo. 1所 示； 双链小RNA分子的反向序列为：5' -AsUsACUUAUAGUCUACUACAsUsUsUs-Chol3'，如SEQ ID No. 2所示； 反向序列进行化学修饰：3'端胆固醇修饰，5'端两个硫代修饰，3'端4个硫代修饰， 反向序列全碱基甲基化修饰。2. 如权利要求1所述的淡水鱼静息态肌卫星细胞稳定剂的用途，其特征在于，用于维 持淡水鱼肌卫星细胞的静息状态。3.根据权利要求2所述的淡水鱼静息态肌卫星细胞稳定剂的用途，其特征在于，所述 的淡水鱼静息态肌卫星细胞稳定剂的用途，用于抑制淡水鱼血清应答因子的表达。
【专利摘要】本发明公开了一种淡水鱼静息态肌卫星细胞稳定剂，其成分是经过标记与化学修饰的化学合成的双链小RNA分子，其中：双链小RNA分子的正向序列为：5′-AAAUGUAGUAGACUAUAAGUAU-3′；双链小RNA分子的反向序列为：5′-AsUsACUUAUAGUCUACUACAsUsUsUs-Chol3′；反向序列进行化学修饰：3′端胆固醇修饰，5′端两个硫代修饰，3′端4个硫代修饰，反向序列全碱基甲基化修饰。本发明人工合成了维持淡水鱼肌卫星细胞静息态的新型小RNA化合物，制作的稳定剂能够明显抑制促肌卫星细胞激活的主要蛋白含量，维持淡水鱼肌卫星细胞静息状态。
【IPC分类】A01K67/027, C12N15/113
【公开号】CN105368835
【申请号】CN201510735082
【发明人】褚武英, 唐利芝, 胡博旸, 李玉珑
【申请人】湖南农业大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月3日