一种制备具有抗氧化活性鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物活性多糖提取的技术领域，具体涉及一种制备具有抗氧化活性鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖的方法。
【背景技术】
[0002]—直以来，蘑菇被认为是食用和医药原料的重要来源之一，但自然界中仍然有大量的具有医药产品前景的蘑菇资源未被开发利用。据报道，蘑菇中含有大量具有生物活性的大分子，特别是具有抗癌和免疫刺激活性的多糖类物质受到越来越多的关注。研究表明，担子菌类蘑菇中的子实体、菌丝体和发酵液中均有生物活性多糖存在。因此，如何开发新的蘑菇资源并利用现代化技术制备各种生物活性多糖越来越受到科研人员的关注。
[0003]鳞伞属是蘑菇球盖茹科中的一个小家族，约包含150余种，含有丰富的维生素，氨基酸，微量元素，脂类和多糖，同时鳞伞菌中有多种抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血脂等作用的生物活性物质。鼎湖鳞伞菌(Phol1ta dinghuensis Bi)于1985年在中国广东省被发现，经过鉴定属于鳞伞属中的新种，而且是中国特有的新种，但目前对鼎湖鳞伞菌中活性物质的研究报道较少。
[0004]与培育真菌子实体相比，液体深层发酵法制备菌丝体具有占地少、生产周期短、单位产率高的优点，且生产过程容易控制，目标产品质量高。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供一种高效制备具有抗氧化活性鼎湖鳞伞胞内、胞外多糖的方法，实现本发明的具体方案如下:
[0006](1)将鼎湖鳞伞菌种在马铃薯斜面培养基上于隔水式恒温培养箱中28°C培养8-10天，直至菌丝长满斜面。
[0007](2)从马铃薯斜面培养基上挑取0.5cm2大小的母种块，接种于种子培养基中，于28°C静止培养12小时后，150rpm下振荡培养10-15天。种子培养基配方(g/L):葡萄糖20，蛋白质胨3，酵母膏4，磷酸二氢钾1，硫酸镁1 ;装液量为100mL/250mL。
[0008](3)取步骤(2)中的种子液接种到发酵培养基中，接种量为15% (V/V)，于28°C、120rpm的条件下培养10-15天，发酵培养基配方(g/L):葡萄糖45 ;酵母膏6，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁0.5，马铃薯100，麦芽粉2.5 ;装液量为200mL/500mL。
[0009](4)将发酵产物用滤纸进行减压过滤，得到鼎湖鳞伞的菌丝体和发酵液；将菌丝体用去离子水冲洗三次，55°C烘干至恒重，粉碎，过60目筛，用去离子水以料液比1: 10，于90°C热水浴中提取3小时，滤渣重复提取一次，合并提取液；将菌丝体提取液和发酵液分别经4000rpm离心15min，取上清，真空浓缩至原体积的1/5，加入3倍体积的酒精，充分混勾，4°C下静置过夜，4000rpm离心20min，收集粗多糖沉淀，依次用丙酮和无水乙醚各洗涤两次，复溶后真空冷冻干燥，得鼎湖鳞伞菌胞内、胞外粗多糖。
[0010]液体发酵法制备鼎湖鳞伞菌胞内、胞外粗多糖产量分别为429mg/L和930mg/L。
[0011](5)粗多糖溶解液上样于DEAE Sepharose Fast Flow (2.0 X 60cm)，并分别用去离子水、0.lmol/L NaCl和0.3mol/L NaCl进行洗脱收集，流速为2mL/min。采用硫酸-苯酸法检测洗脱液中的多糖含量，合并相同组分，50°C旋转蒸发浓缩，去离子水透析2d，真空冷冻干燥，分别得胞内、胞外多糖组分。
[0012](6)将步骤(5)所得胞内、胞外多糖组分经S印hadex G-100凝胶柱纯化后得胞内、胞外纯化多糖组分，并配制成一系列浓度溶液，测定其对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除能力。
[0013]制备的鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基均有一定的清除能力。
[0014]2、根据专利要求1所述的一种制备具有抗氧化活性鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖的方法，其特征在于:采用液体深层发酵法培养鼎湖鳞伞菌，同时提取胞内、胞外多糖，产量分别为 429mg/L 和 930mg/L。
【附图说明】
[0015]图1鼎湖鳞伞菌丝体多糖的DEAE凝胶柱梯度洗脱曲线
[0016]图2鼎湖鳞伞菌胞外多糖的DEAE凝胶柱梯度洗脱曲线
[0017]图3鼎湖鳞伞菌胞外多糖对DPPH自由基的清除活性
[0018]图4鼎湖鳞伞菌胞外多糖对羟基自由基的清除活性
[0019]图5鼎湖鳞伞菌胞外多糖对超氧阴离子自由基的清除活性
【具体实施方式】
[0020]下面通过实施例，对本发明作进一步描述。
[0021]实施例1:
[0022](1)将鼎湖鳞伞菌种在马铃薯斜面培养基上于隔水式恒温培养箱中28°C培养8-10天，直至菌丝长满斜面。
[0023](2)从马铃薯斜面培养基上挑取0.5cm2大小的母种块，接种于种子培养基中，于28°C静止培养12小时后，150rpm下振荡培养10-15天。种子培养基配方(g/L):葡萄糖20，蛋白质胨3，酵母膏4，磷酸二氢钾1，硫酸镁1 ;装液量为100mL/250mL。
[0024](3)取步骤(2)中的种子液接种到发酵培养基中，接种量为15% (V/V)，于28°C、120rpm的条件下培养10-15天，发酵培养基配方(g/L):葡萄糖45 ;酵母膏6，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁0.5，马铃薯100，麦芽粉2.5 ;装液量为200mL/500mL。
[0025](4)将发酵产物用滤纸进行减压过滤，得到鼎湖鳞伞的菌丝体和发酵液；将菌丝体用去离子水冲洗三次，55°C烘干至恒重，粉碎，过60目筛，用去离子水以料液比1: 10，于90°C热水浴中提取3小时，滤渣重复提取一次，合并提取液；将菌丝体提取液和发酵液分别经4000rpm离心15min，取上清，真空浓缩至原体积的1/5，加入3倍体积的酒精，充分混勾，4°C下静置过夜，4000rpm离心20min，收集粗多糖沉淀，依次用丙酮和无水乙醚各洗涤两次，复溶后真空冷冻干燥，得鼎湖鳞伞菌胞内、胞外粗多糖。
[0026]液体发酵法制备鼎湖鳞伞菌胞内、胞外粗多糖产量分别为429mg/L和930mg/L。
[0027]实施例2:
[0028]鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖的分离纯化及体外抗氧化活性分析
[0029](1)粗多糖溶解液上样于DEAE Sepharose Fast Flow (2.0 X 60cm)，并分别用去离子水、0.lmol/L NaCl和0.3mol/L NaCl进行洗脱收集，流速为2mL/min。采用硫酸-苯酸法检测洗脱液中的多糖含量，合并相同组分，50°C旋转蒸发浓缩，去离子水透析2d，真空冷冻干燥，分别得胞内、胞外多糖组分。
[0030](2)将步骤(5)所得胞内、胞外多糖组分经S印hadex G-100凝胶柱纯化后得胞内、胞外纯化多糖组分，并配制成一系列浓度溶液，测定其对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除能力。
[0031]制备的鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基均有一定的清除能力。
[0032]鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖产量按下面公式计算:
[0033]多糖产量(mg/L)=[粗多糖质量(mg)/发酵液体积(L)]
[0034]DPPH 清除率(％ ) = [A0- (ArA2) ]/A0X100%
[0035]其中A。为对照实验(水代替样品溶液)的吸光值；
[0036]Ai为样品实验的吸光值；
[0037]^为样品干扰实验(无水乙醇代替DPPH溶液)的吸光值。
[0038]羟基清除率(%) = [ (A2_Ai) / (Ao-Ai) ] X 100%
[0039]其中:
[0040]A。-正常管(50 μ L 邻二氮菲 +75 μ L PBS+50 μ L FeS04+100 μ L H20)的吸光值；[0041 ] A「阴性对照管(50 μ L邻二氮菲 +75 μ L PBS+50 μ L FeS04+50 μ L H20+50 μ L H202)的吸光值；
[0042]A2-样品管(50 μ L邻二氮菲 +75 μ L PBS+50 μ L FeS04+50 μ L 多糖 +50 μ L H202)的吸光值。
[0043]超氧阴离子自由基清除率) = [A0-(A1-A2)]/A0X100%
[0044]其中:
[0045]A。-对照实验(水代替样品溶液)的吸光值；
[0046]A1-样品实验的吸光值；
[0047]A2-样品干扰实验(0.1M pH 7.4酸盐缓冲液代替NBT溶液)的吸光值。
【主权项】
1.一种液体发酵制备鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖的方法，其特征在于包括以下操作步骤: (1)将鼎湖鳞伞菌种在马铃薯斜面培养基上于隔水式恒温培养箱中28°C培养8-10天，直至菌丝长满斜面。 (2)从马铃薯斜面培养基上挑取0.5cm2大小的母种块，接种于种子培养基中，于28°C静止培养12小时后，150rpm下振荡培养10-15天。种子培养基配方(g/L):葡萄糖20，蛋白质胨3，酵母膏4，磷酸二氢钾1，硫酸镁1 ;装液量为100mL/250mL。 (3)取步骤(2)中的种子液接种到发酵培养基中，接种量为15%(V/V)，于28°C、120rpm的条件下培养10-15天，发酵培养基配方(g/L):葡萄糖45 ;酵母膏6，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁0.5，马铃薯100，麦芽粉2.5 ;装液量为200mL/500mL。 (4)将发酵产物用滤纸进行减压过滤，得到鼎湖鳞伞菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用去离子水冲洗三次，55°C烘干至恒重，粉碎，过60目筛，用去离子水以料液比1: 10，于90°C热水浴中提取3小时，滤渣重复提取一次，合并提取液；将菌丝体提取液和发酵液分别经4000rpm离心15min，取上清，真空浓缩至原体积的1/5，加入3倍体积的酒精，充分混勾，4°C下静置过夜，4000rpm离心20min，收集粗多糖沉淀，依次用丙酮和无水乙醚各洗涤两次，复溶后真空冷冻干燥，得鼎湖鳞伞菌胞内、胞外粗多糖。 液体发酵法制备鼎湖鳞伞菌胞内、胞外粗多糖产量分别为429mg/L和930mg/L。 (5)粗多糖溶解液上样于DEAESepharose Fast Flow(2.0X60cm)，并分别用去离子水、0.lmol/L NaCl和0.3mol/L NaCl进行洗脱收集，流速为2mL/min。采用硫酸-苯酸法检测洗脱液中的多糖含量，合并相同组分，50°C旋转蒸发浓缩，去离子水透析2d，真空冷冻干燥，分别得胞内、胞外多糖组分。 (6)将步骤(5)所得胞内、胞外多糖组分经SephadexG-100凝胶柱纯化后得胞内、胞外纯化多糖组分，并配制成一系列浓度溶液，测定其对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除能力。 制备的鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基均有一定的清除能力。2.根据专利要求1所述的一种制备具有抗氧化活性鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖的方法，其特征在于:采用液体深层发酵法培养鼎湖鳞伞菌，同时提取胞内、胞外多糖，产量分别为 429mg/L 和 930mg/L。
【专利摘要】本发明涉及一种制备具有抗氧化活性鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖的方法。该方法包括采用液体深层发酵法培养鼎湖鳞伞菌，菌丝体用去离子水冲洗三次，经干燥、粉碎、热水浸提、乙醇沉淀、复溶、冷冻干燥得菌丝体多糖；发酵液经滤膜分离、减压浓缩、乙醇沉淀、复溶、冷冻干燥得胞外多糖。体外清除DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的实验表明鼎湖鳞伞菌胞外多糖具有一定的体外抗氧化活性。本发明综合利用鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖，具有利用率高、工艺温和、成本低等优点，为开发利用药用真菌资源开辟了新的途径。
【IPC分类】C12R1/645, C12P19/04
【公开号】CN105368895
【申请号】CN201510656990
【发明人】曾晓雄, 邱丽淳, 吴凡
【申请人】南京农业大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年10月10日