一种从白耙齿菌中提取多肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及多肽的提取。更具体地，涉及一种从白耙齿菌中提取多肽的方法。
【背景技术】
[0002]白耙齿菌(Irpex lacteus)为耙齿菌的一种，耙齿菌分为灰色、白色、褐色等几个品种，白耙齿菌与其他几个品种相比，其药用价值最高，且生物活性是其他品种的近10倍。白耙齿菌是独产于长白山密林深处的一种珍贵的食药用菌，只在雷雨天后进行生长繁殖。白耙齿菌含有多糖、肽、皂甙、有机酸、生物碱及17种氨基酸，以及多种细胞强化营养素，具有软化血管壁，恢复毛细血管弹性，促进肾小球、肾小管的再生，改善肾小球的微循环，增加肾小球的血流量，提高肾小球的滤过功能，恢复肾脏的活力，尤其在治疗肾炎，肾小球炎、尿蛋白等方面有显著疗效。
[0003]肽是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，因氨基酸的组份和顺序各不相同而组成不同的肽。含两个氨基酸的称二肽，含三个的称三肽，依次类推。肽是精准的蛋白质片断，其分子只有纳米般大小，肠胃，血管及肌肤皆极容易吸收在，在人体内起重要生理作用及功能。具有活性的多肽称为活性肽，又称生物活性肽或生物活性多肽，可分为:多肽类激素、神经多肽和脑肽、激肽、蛙皮肽和昆虫肽等，目前，肽成为全世界研究的热点、大量的国内外研究结果表明:不同的生物肽具有不同的结构和生理功能，如抗病毒、抗癌、抗血栓、抗高血压、免疫调节、激素调节、抑菌、降胆固醇等作用。
[0004]白耙齿菌由于其显著的药理活性越来越受到研究学者们的关注，目前在国内外现有的报道中，对于白耙齿菌的研究多集中在对菌种的发酵培养、多糖、氨基酸等活性成分及药理活性上，而对于白耙齿菌的另外一种重要活性物质一一肽的相关研究尤其是肽的制备未见报道，关于多肽的制备方法有很多，化学合成法成本比较高，且副反应多；提取法过程复杂；基因重组法存在生产效率的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的在于提供一种从白耙齿菌中提取多肽的方法，该方法简单，且所得多肽纯度达70%以上。
[0006]为达到上述目的，本发明采用下述技术方案:
[0007]—种从白耙齿菌中提取多肽的方法，包括如下步骤:
[0008]1)将白耙齿菌去杂，冷冻干燥，粉碎至40目，用超临界C(V流体萃取法脱脂，得到白耙齿菌粉末；
[0009]2)向上述所得白耙齿菌粉末中加入质量浓度为0.2-0.3%的NaOH溶液，于4°C温度下静置8-10h，每隔30-40min搅拌一次；
[0010]3)将步骤2)所得物离心，去除上清液；
[0011]4)向步骤3)所得溶液中加入质量浓度5%的蛋白酶，将溶液PH调至7-8，加热，恒温酶解，酶解完全后，加热至酶灭活，降温至室温，过滤得滤液；
[0012]5)将步骤4)所得滤液过5000道尔顿超滤膜超滤，得超滤液，冻干，所得冻干粉即为白耙齿菌多肽。
[0013]优选地，步骤2)中，白耙齿菌粉末与NaOH溶液的质量比为1:25-1:30 ;所述提取的时间为10-12h。
[0014]优选地，步骤3)中，所述离心的离心速度为3000_3500r/min，离心时间为20-25mino
[0015]优选地，步骤4)中，所述蛋白酶选自酶活力为50u/mg的木瓜蛋白酶或酶活力为1000u/mg的中性蛋白酶。
[0016]优选地，步骤4)中，所述酶解的温度为45-60 °C，酶解时间为3_5h。
[0017]本发明中，用超临界C(V流体萃取法脱脂的具体方法是:将白耙齿菌粉末放入萃取池中，0)2和甲醇分别由C0 2栗和修饰剂栗打入各栗的腔体中，经流体混合器混合后，流入萃取器中的集流腔，在集流腔压力达27.6MPa，温度达31°C后，进入萃取池开始萃取，动态萃取时，超临界C(V流体经限流器流入收集瓶后减压排放，流体带出的物质溶于收集液中予以收集，在30、60、90、120min各收集1次，收集液减压浓缩，干燥。
[0018]本发明的有益效果如下:
[0019]本发明的方法中采用冻干法将白耙齿菌冷冻干燥，且在低温4°C条件下用NaOH提取出蛋白质及肽类物质，有效地保持了白耙齿菌中多肽的活性；进一步的采用蛋白酶对提取物进行酶解，不加入试剂发酵，安全无污染，投入生产设备少，且副反应及附加产物少。
[0020]本发明研究工艺简单且成本低，易于操作和推广，同时可有效提高产物的得率，采用超滤的方法又进一步提高了所得多肽的纯度。
【具体实施方式】
[0021]为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0022]实施例1
[0023]从白耙齿菌中提取多肽的方法，包括如下步骤:
[0024]1)取100g白耙齿菌，去杂，冷冻干燥，并粉碎至40目，用超临界C(V流体萃取法脱月旨。具体方法为:将白耙齿菌粉末放入萃取池中，C02和甲醇分别由C02栗和修饰剂栗打入各栗的腔体中，经流体混合器混合后，流入萃取器中的集流腔，在集流腔压力达27.6MPa，温度达31°C后，进入萃取池开始萃取，动态萃取时，超临界0)2流体经限流器流入收集瓶后减压排放，流体带出的物质溶于收集液中予以收集，在30、60、90、120min各收集1次，收集液减压浓缩，干燥，得白耙齿菌粉末；
[0025]2)将白耙齿菌粉末溶于质量浓度为0.3%的NaOH溶液中，白耙齿菌粉末与NaOH溶液的质量比为1:25，在4°C温度下静置8h，每隔30min搅拌一次；
[0026]3)将步骤2)所得物在转速为3000r/min的离心机中离心，离心时间为20min，去除离心后的上清液；
[0027]4)向步骤3)所得溶液中加入质量浓度为5%的酶活力为50u/mg的木瓜蛋白酶，将溶液PH调至7，加热，在45°C温度下恒温酶解3h，酶解完全后，高温使酶灭活，降温至室温，过滤得滤液；
[0028]5)将步骤4)所得滤液过5000道尔顿超滤膜超滤，得超滤液，冻干，所得冻干粉即为白耙齿菌多肽。本方法白耙齿菌多肽的提取率为0.27%，提取得到的白耙齿菌多肽的纯度为71%。
[0029]实施例2
[0030]从白耙齿菌中提取多肽的方法，包括如下步骤:
[0031]1)取100g白耙齿菌，去杂，冷冻干燥，并粉碎至40目，用超临界C(V流体萃取法脱月旨。具体方法为:将白耙齿菌粉末放入萃取池中，C02和甲醇分别由C02栗和修饰剂栗打入各栗的腔体中，经流体混合器混合后，流入萃取器中的集流腔，在集流腔压力达27.6MPa，温度达31°C后，进入萃取池开始萃取，动态萃取时，超临界0)2流体经限流器流入收集瓶后减压排放，流体带出的物质溶于收集液中予以收集，，在30、60、90、120min各收集1次，收集液减压浓缩，干燥，得白耙齿菌粉末；
[0032]2)将白耙齿菌粉末溶于质量浓度为0.3%的NaOH溶液中，白耙齿菌粉末与NaOH溶液的质量比为1:30，在4°C温度下静置10h，每隔40min搅拌一次；
[0033]3)将步骤2)所得物在转速为3500r/min的离心机中离心，离心时间为25min，去除离心后的上清液；
[0034]4)向步骤3)所得溶液中加入质量浓度为5%的酶活力为1000u/mg的中性蛋白酶，将溶液PH调至8，加热，在60°C温度下恒温酶解5h，酶解完全后，高温使酶灭活，降温至室温，过滤得滤液；
[0035]5)将步骤4)所得滤液过5000道尔顿超滤膜超滤，得超滤液，冻干，所得冻干粉即为白耙齿菌多肽。本方法白耙齿菌多肽的提取率为0.36%，提取得到的白耙齿菌多肽的纯度为72.4%。
[0036]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1.一种从白耙齿菌中提取多肽的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)将白耙齿菌去杂，冷冻干燥，粉碎至40目，用超临界C(V流体萃取法脱脂，得到白耙齿菌粉末； 2)向上述所得白耙齿菌粉末中加入质量浓度为0.2-0.3%的NaOH溶液，于4°C温度下静置8-10h，每隔30-40min搅拌一次； 3)将步骤2)所得物离心，去除上清液； 4)向步骤3)所得溶液中加入质量浓度5%的蛋白酶，将溶液PH调至7-8，加热，恒温酶解，酶解完全后，加热至酶灭活，降温至室温，过滤得滤液； 5)将步骤4)所得滤液过5000道尔顿超滤膜超滤，得超滤液，冻干，所得冻干粉即为白耙齿菌多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，白耙齿菌粉末与NaOH溶液的质量比为1:25-1:30 ;所述提取的时间为10-12ho3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述离心的离心速度为3000-3500r/min，离心时间为 20_25min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述蛋白酶选自酶活力为50u/mg的木瓜蛋白酶或酶活力为1000u/mg的中性蛋白酶。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述酶解的温度为45-60°C，酶解时间为3-5h。
【专利摘要】本发明公开了一种从白耙齿菌中提取多肽的方法，包括如下步骤：将白耙齿菌除杂、冷冻、粉碎后，用超临界CO2流体萃取法脱脂，再用NaOH溶液提取出蛋白质及肽类物质，进一步酶解、超滤后完成白耙齿菌中多肽的提取。本发明方法工艺简单，安全无污染，所得产物纯度及提取率高，且副反应及附加产物少，易于操作和推广，适合工业化生产。
【IPC分类】C12P21/06, C07K1/12, C07K1/34
【公开号】CN105368907
【申请号】CN201510979858
【发明人】李春娥, 郭奕, 杨静, 杨坤
【申请人】通化吉通药业有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月23日