粪菌保存液及其保存粪菌的方法

粪菌保存液及其保存粪菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医疗检测领域，特别涉及一种粪菌保存液以及采用此保存液保存粪菌的方法。
【背景技术】
[0002]肠道菌群的结构失调是诱发各种慢性病的重要因素，近年来国内外研究发现通过“奠菌移植”(fecal microb1ta transplantat1n，FMT)，即用来自健康人的肠道菌群，恢复慢性病人体内菌群结构的平衡，重建具有正常结构的肠道微生态，可以促进菌群功能的康复，从而达到肠道及肠道外疾病的治疗效果。迄今，国内外均有采用粪菌移植方法成功治愈或缓解难辨梭状芽孢杆菌感染(CDI)、炎症性肠病等胃肠道相关性疾病的临床报道。2013年，美国FDA将FMT收录到复发性CDI的标准治疗指南中。虽然“粪菌移植”的治疗临床效果显著，但是其在医学领域内的推广和应用仍有诸多问题有待解决，比如FMT的标准化建立。其中，粪菌液的保存是FMT中的必要步骤。当菌群离开肠道后，其所处环境即发生变化，其活性和构成比例可能会受到影响。为了保证临床移植的治疗效果，需采用一种有效的保存方法和手段来维持肠道菌群的活性和构成比例。
[0003]目前临床上一般采用冷藏法用于直接保存人体粪便，即当粪便采集后立即冻存在-20°C或者更低的温度中，由于细菌在低温状态下代谢速率降低，因此可以在一段时间内维持粪便中细菌的构成，从而达到稳定其微生物构成的目的。当需要进行FMT操作时，将冻存品再通过分离方法得到粪菌，这不仅增加了粪菌分离的难度和工作量，也需要更大的存储空间。此外，粪菌如作为一种治疗方法中的“药品”，不能够直接在临床中应用，反而需要先冻存粪便再提取后使用，这样的治疗过程无疑会增加操作和设备的依赖性，会阻碍粪菌移植治疗方法的发展。同时，我国很多医疗机构并不具备对粪菌进行分离的能力。因此，尽管专利文献一种粪便保存液(CN104480012A)报道了利用Η)ΤΑ盐及柠檬酸钠等物质，以水和乙醇作为溶剂配制的保存液能够将粪便样本在密封常温下保存一周，但这种方法不适于对粪菌移植中的粪菌进行保存。
[0004]目前临床在粪菌移植过程中常采用磷酸盐缓冲液(PBS)与供体粪菌混合，由于混合液的流体特征，临床上采用内镜下喷射或者灌肠过程中，与肠道壁接触时间短，影响粪菌定植效果。粪菌液如需保存，则需要额外加入甘油，过多的步骤容易增加外源性感染的机会。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供能够有效保护肠道菌群活性和丰度。从而保证粪菌移植效果的保存液，以及采用上述保存液保存粪菌的方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:一种粪菌保存液，按重量百分比包括以下组分:0.9 %的氯化钠，0.5 %?2.0 %的维生素C，20 %?50 %的甘油，其余为无菌纯化水，所述保存液的pH值为7.0?7.4。
[0007]—种保存液保存粪菌的方法，包括以下步骤:
(1)将收集粪便分离后得到的粪菌，每50g粪便得到的粪菌用100mL保存液重悬，然后在_80°C冻存保存；
(2)使用时，先将粪菌冻存物在冰浴中解冻，然后稀释到250mL的无菌生理盐水中，供粪菌移植使用。
[0008]本发明涉及一种粪菌保存液的配方，按照配方所述配制粪菌保存液。将采集的新鲜粪便，经搅拌、离心、重悬、过滤等步骤直接采用粪菌保存液保存，或者直接采用粪菌分离系统分离得到粪菌，然后直接将粪菌置于保存液中，-80°C以下冻存，即可达到稳定其中微生物构成的作用，保存时间长达3个月。使用该配方保存液，在相应的保存条件下，能够保证粪菌中微生物的数量和丰度不影响后续粪菌移植的治疗效果，为粪菌移植标准化提供了可能。
[0009]本发明中的粪菌保存液很好地保护了肠道菌群的活性和丰度，从而保证了粪菌移植效果，同时也简化了粪菌移植操作，目前临床上无本发明所描述的类似产品或方法面市。
[0010]本发明配方能够在简单的保存条件下，对粪菌进行长达3个月的保存，保证其微生物构成仍与最初分离提取时的微生物构成相似。从配方构成角度来看，本发明具有成本低，配制简单等特点，这将有助于粪菌治疗的发展；从具体实施案例的结果来看，本发明的配方，能够实现在常规保存条件下，维持粪菌长达3个月基本不变，这为粪菌移植标准化提供了主要保障。
【附图说明】
[0011]图1是实施例中4位志愿者的粪便样本做3种不同处理后的DNA扩增结果比较。
[0012]图2是实施例中3位志愿者的粪便样品用粪菌液保存前后的细菌丰富度图变化。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0014]—种粪菌保存液，按重量百分比包括以下组分:0.9%的氯化钠，0.5%的维生素C，50%的甘油，其余为无菌纯化水，保存液的pH值为7.4。
[0015]将收集粪便分离后得到的粪菌，每50g粪便得到的粪菌用100mL保存液重悬，然后在-80°C冻存保存。
[0016]使用时，先将粪菌冻存物在冰浴中解冻，然后稀释到250mL的无菌生理盐水中，供粪菌移植使用。
[0017]采集了 4位志愿者的粪便样本，并利用粪菌分离系统分离得到对应的粪菌。每个志愿者的粪菌分为3份，分别做3种不同处理:
(1)立即处理:将一份分离得到的粪菌分散在无菌生理盐水中，每50g粪便分离得到的粪菌分散于100mL生理盐水。取300 yL，立即进行DNA提取，核糖体16S RNA基因第四可变区扩增等处理。
[0018](2)粪菌保存液_80°C保存3个月:将一份分离得到的粪菌分散在粪菌保存液中，每50g粪便分离得到的粪菌分散于100mL保存液，-80°C冻存3个月。然后冰浴解冻后取300 μ L，进行DNA提取，核糖体16S RNA基因第四可变区扩增等处理。
[0019](3)不加保存液-80°C保存3个月:将一份分离得到的粪菌分散在无菌生理盐水中，每50g粪便分离得到的粪菌分散于100mL生理盐水，-80°C冻存3个月。然后冰浴解冻后取300 μ L，进行DNA提取，核糖体16S RNA基因第四可变区扩增等处理。
[0020]4位志愿者的粪便样本进行DNA提取，核糖体16S RNA基因第四可变区扩增处理的步骤如下:
(l)DNA 提取:
将300 μ L粪菌溶液置于含0.1mm硅球的1.5mL离心管中；然后，加入含50 μ L溶菌酶(10mg/ml)、6 μ L变溶菌素(25000U/mL)和3 μ L溶葡球菌酶的PBS，充分混匀后37°C温育30分钟；接着，加入10 μ L蛋白酶K(20mg/ml)、100 μ L浓度为10%的SDS (十二烷基苯磺酸钠)和20 yL核糖核酸酶A(20mg/ml)，涡旋震荡充分混匀后55°C温育45分钟；随后，采用磨珠均质器裂解细胞；最后按说明书使用ZYMO Research公司的粪便DNA提取试剂盒提取纯化DNA。
[0021](2)核糖体16S RNA基因第四可变区扩增:
试剂(Takara公司):
引物:上游:27F-59-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-39 和下游 338R-59-GCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNCATGCTGCCTCCCGTAGGAG-T-39 ；.Taq DNA 聚合酶；.MgC12 ；2.5mmol/L dNTP Mixture ；ddH20 ；lOx Ex Taq Buffer (不含镁离子)；DNA模板。
[0022]操作步骤:
每个 PCR 反应体系为 25 μ L，包括:15.75 μ L ddH20, 2.5 μ L 10x Ex Taq Buffer，2yLdNTP Mixture, 1.5 yL MgCl2,0.25 μ L Taq DNA 聚合酶，上游引物和下游引物各 0.5 μ L，2 μ L 模板 DNA。
[0023]在每个EP管中分装好每个25 μ L的PCR反应体系后，按照以下PCR程序扩增反应:
(step 1):94 °C, 2min ； (step 2):92 °C, 30s ； (step 3):52 °C, 30s ； (step 4):72 °C,45s ； (step 5):go to step 2，29cycles ; (step 6):72°C, 5min ； (step 7):4°C, forever ；(step 8):end
扩增得到的片段，送往测序公司进行高通量测序，获得序列后进行后续生物信息分析，得到菌群结果。
[0024]4位志愿者的粪便样本做3种不同处理后的DNA扩增结果比较见图1。图中:
1.志愿者1样品立即处理；2.志愿者1样品保存液-80°c保存3个月；3.志愿者1样品直接-80°C保存3个月；4.志愿者2样品立即处理；5.志愿者2样品保存液-80°C保存3个月；6.志愿者2样品直接-80°C保存3个月；7.志愿者3样品立即处理；8.志愿者3样品保存液-80°C保存3个月；9.志愿者3样品直接-80°C保存3个月；10.志愿者4样品立即处理；11.志愿者4样品保存液_80°C保存3个月；12.志愿者4样品直接_80°C保存3个月；M:Marker。
[0025]3位志愿者粪便样品用粪菌液保存的样品进行处理，并送测序公司进行高通量测序，通过生物信息学方法分析，细菌丰富度对比比较见图2。图中可以看出:粪便细菌组成相似，每种菌群丰度变化不明显，说明粪菌保存液可以保证粪菌在_80°C条件下保持良好的活性及菌群组成，为今后的粪菌移植工作提供保障。
[0026]如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。
【主权项】
1.一种粪菌保存液，其特征在于按重量百分比包括以下组分:0.9%的氯化钠，0.5%?2.0%的维生素C，20%?50%的甘油，其余为无菌纯化水，所述保存液的pH值为7.0 ?7.4o2.一种根据权利要求1所述的粪菌保存液保存粪菌的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将收集粪便分离后得到的粪菌，每50g粪便得到的粪菌用100mL保存液重悬，然后在_80°C冻存保存； (2)使用时，先将粪菌冻存物在冰浴中解冻，然后稀释到250mL的无菌生理盐水中，供粪菌移植使用。
【专利摘要】本发明公开了一种粪菌保存液以及采用上述保存液保存粪菌的方法，粪菌保存液，按重量百分比包括以下组分：0.9％的氯化钠，0.5％～2.0％的维生素C，20％～50％的甘油，其余为无菌纯化水，所述保存液的pH值为7.0～7.4。本发明配方能够在简单的保存条件下，对粪菌进行长达3个月的保存，保证其微生物构成仍与最初分离提取时的微生物构成相似。从配方构成角度来看，本发明具有成本低，配制简单等特点，这将有助于粪菌治疗的发展；从具体实施案例的结果来看，本发明的配方，能够实现在常规保存条件下，维持粪菌长达3个月基本不变，这为粪菌移植标准化提供了主要保障。
【IPC分类】C12N1/04
【公开号】CN105385599
【申请号】CN201511009229
【发明人】叶峰, 王晓艳
【申请人】南京医科大学第一附属医院
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2016年1月21日