一种卡贝缩宫素的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多肽类药物的纯化方法，具体涉及一种合成卡贝缩宫素的纯化方 法。
【背景技术】
[0002] 卡贝缩宫素为一种环状多肽，结构式如下。
[0003] 化学结构简式如下。
[0004] 卡贝缩宫素是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物，对非妊娠的 子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用，其临床和药 理特性与天然产生的催产素类似。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体 结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊 娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。硬膜外或腰麻下 剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以预防子宫张力不足和产后出血。
[0005] 不论是静脉注射还是肌肉注射卡贝缩宫素后，子宫迅速收缩，可在两分钟内达到 一个明确强度。单剂量静脉注射卡贝缩宫素对子宫的活性作用可持续大约一个小时，因此 足以预防刚生产后的产后出血。产后给予卡贝缩宫素后，在收缩的频率与幅度方面都比催 产素要长，并且对有出血倾向、需额外使用缩宫素者，卡贝缩宫素耐受性好，与缩宫素一样 有效甚至更有效。目前临床常用的促进子宫缩收药物麦角新碱，会导致恶心、呕吐、高血压 和冠脉痉挛等。卡贝缩宫素是一种长效的类催产素药物。与麦角新碱相比，使用卡贝缩宫 素在预防阴道分娩妇女的产后出血方面同样有效，并且恶心、呕吐、高血压的发生比例显著 降低。因此，卡贝缩宫素在临床应用上，具有广阔的市场前景。
[0006] 卡贝缩宫素常用纯化方法通常包括反相高效液相色谱法、凝胶法、离子交换法等， 采用任何一种单一方法，都很难分离得到高纯产品（> 99%)，或者收率较低（小于50%)。目 前，很少有关于其分离纯化方面的研究报道，程生强，马亚平等在其研究中报道，以磷酸缓 冲液作为洗脱液，采用反相高效液相色谱法纯化卡贝缩宫素，并采用离子交换法转盐，得到 醋酸卡贝缩宫素，收率为70%_75%，目的肽纯度为98%。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术存在的收率低、纯度低和纯化困难的技术问题，本发明人进行 了大量的研究，从而完成了本发明。
[0008] 本发明通过以下技术方案实现，具体而言，涉及一种卡贝缩宫素的纯化方法，该方 法可制备出纯度大于99%，单个杂质小于0. 1%的药用原料药。其特征在于，所述的方法包括 以下步骤： 步骤1、将卡贝缩宫素粗品用1%醋酸溶液溶解，制成溶液； 步骤2、将卡贝缩宫素的乙酸溶液装入到半透膜中，置于缓冲液中，于20~30°C下搅拌 渗滤至缓冲液pH=2. 0~3. 0 ; 所述的半透膜为纤维素酯膜（即CE膜）或再生纤维素膜（即RC膜)，截留分子量为500 道尔顿。所述的缓冲液为醋酸盐缓冲液（PH3. 5)，缓冲液与卡贝缩宫素的乙酸溶液的体积比 为 30~40:1 ; 步骤3、将含卡贝缩宫素的乙酸溶液的半透膜转至纯化水中，于20~30°C下搅拌渗滤至 半透膜内溶液pH=3. 5~4. 5,其中纯化水与卡贝缩宫素的乙酸溶液的体积比为50~60:1 ; 步骤4、将半透膜中的卡贝缩宫素溶液取出，采用反相色谱法进行纯化，收集含卡贝缩 宫素的洗脱馏分； 步骤5、将含卡贝缩宫素的洗脱馏分浓缩出75~85%，剩余物倒入冻干盘中，放入冻干机 进行冷冻干燥，得到卡贝缩宫素纯品。
[0009] 所述的浓缩条件为蒸馏温度小于60°C，真空度为0. 085~0. 095Mpa。
[0010] 根据上述的一种卡贝缩宫素的纯化方法，步骤4中，所述的反向色谱法进行纯化， 纯化的具体色谱条件为： 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，柱子直径和长度为50mmX 250mm 流动相：A : 1%冰醋酸水溶液 B:乙腈 检测波长：230nm 流速：80ml/min 洗脱梯度：
[0011] 根据上述的一种卡贝缩宫素的纯化方法，步骤5中，所述的冷冻干燥，具体操作过 程为：预冻至-45~-40°c后保温2h，开真空栗抽真空并使真空度恒定在IOOKPa以下。期 间自然升温，真空干燥12h。
[0012] 本发明的积极有益效果。
[0013] 1、通过半透膜技术，将粗品中的部分小分子杂质及溶剂除去，简化纯化步骤。
[0014] 2、采用半透膜技术进行初步纯化，操作简单，无需特殊设备，半透膜可重复使用， 有利于降低成本。同时，采用半透膜技术进行初步纯化，无需浓缩即可进行色谱纯化，减少 高温浓缩步骤，降低多肽高温降解几率，确保收率和纯度。
[0015] 3、采用半透膜纯化和反向色谱法纯化相结合工艺，确保成品符合纯度大于99%，单 个杂质小于0. 1%的药用原料药标准。
[0016]
【附图说明】： 图1本发明实施例1所得卡贝缩宫素的有关物质图谱。
【具体实施方式】 [0017] 。
[0018] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0019] 实施例1。
[0020] 步骤1、取5g卡贝缩宫素粗肽，加入1%醋酸溶液50ml，配制成10%卡贝缩宫素粗 肽溶液。
[0021] 步骤2、将卡贝缩宫素的乙酸溶液装入到截留分子量为500道尔顿RC半透膜中，装 量为半透膜装量体积的70%，置于2L醋酸盐缓冲液（pH3. 5)缓冲液中，于20~30°C下搅拌渗 滤至缓冲液pH=2. 0~3. 0。
[0022] 步骤3、将含卡贝缩宫素的乙酸溶液的半透膜转至3L纯化水中，于20~30°C下搅拌 渗滤至半透膜袋内溶液pH=3. 5~4. 5。
[0023] 步骤4、将半透膜中的卡贝缩宫素溶液取出，采用反相色谱法进行纯化，收集含卡 贝缩宫素的洗脱馏分，具体色谱条件如下； 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，柱子直径和长度为50mmX 250mm 流动相：A : 1%冰醋酸水溶液 B:乙腈 检测波长：230nm 流速：80ml/min 洗脱梯度：
[0024] 步骤5、将含卡贝缩宫素的洗脱液浓缩出75~85%，控制温度小于60°C，真空度为 0. 09Mpa，浓缩结束后，将剩余物倒入冻干盘中，放入冻干机中，预冻至-45~-40°C后保温 2h，开真空栗抽真空并使真空度恒定在IOOKPa以下。期间自然升温，真空干燥12h，冷冻干 燥结束后，得到卡贝缩宫素纯品。
[0025] 实施例2。
[0026] 步骤1、取5g卡贝缩宫素粗肽，加入1%醋酸溶液50ml，配制成10%卡贝缩宫素粗 肽溶液。
[0027] 步骤2、将卡贝缩宫素的乙酸溶液装入到截留分子量为500道尔顿CE半透膜中，装 量为半透膜装量体积的70%，置于2L醋酸盐缓冲液（pH3. 5)缓冲液中，于20~30°C下搅拌渗 滤至缓冲液pH=2. 0~3. 0。
[0028] 步骤3、将含卡贝缩宫素的乙酸溶液的半透膜转至3L纯化水中，于20~30°C下搅拌 渗滤至半透膜袋内溶液pH=3. 5~4. 5。
[0029] 步骤4、将半透膜中的卡贝缩宫素溶液取出，采用反相色谱法进行纯化，收集含卡 贝缩宫素的洗脱馏分，具体色谱条件如下； 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，柱子直径和长度为50mmX 250mm 流动相：A : 1%冰醋酸水溶液 B:乙腈 检测波长：230nm 流速：80ml/min 洗脱梯度：
[0030] 步骤5、将含卡贝缩宫素的洗脱液浓缩出75~85%，控制温度小于60°C，真空度大 于-〇. 095Mpa，浓缩结束后，将剩余物倒入冻干盘中，放入冻干机中，预冻至-45~_40°C后 保温2h，开真空栗抽真空并使真空度恒定在IOOKPa以下。期间自然升温，真空干燥12h，冷 冻干燥结束后，得到卡贝缩宫素纯品。
【主权项】
1. 一种卡贝缩宫素的纯化方法，该方法可制备出纯度大于99%，单个杂质小于0. 1%的 药用原料药，其特征在于，所述的方法包括W下步骤： 步骤1、将卡贝缩宫素粗品用1%醋酸溶液溶解，制成溶液； 步骤2、将卡贝缩宫素的乙酸溶液装入到半透膜中，置于缓冲液中，于20~30°C下揽拌 渗滤至缓冲液抑=2. 0~3. 0 ; 步骤3、将含卡贝缩宫素的乙酸溶液的半透膜转至纯化水中，于20~30°C下揽拌渗滤至 半透膜内溶液抑=3. 5~4. 5,其中纯化水与卡贝缩宫素的乙酸溶液的体积比为50~60:1 ; 步骤4、将半透膜中的卡贝缩宫素溶液取出，采用反相色谱法进行纯化，收集含卡贝缩 宫素的洗脱馈分； 步骤5、将含卡贝缩宫素的洗脱馈分浓缩出75~85%，剩余物倒入冻干盘中，放入冻干机 进行冷冻干燥，得到卡贝缩宫素纯品。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述的半透膜为纤维素醋膜（即 CE膜）或再生纤维素膜（即RC膜)，截留分子量为500道尔顿。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述的缓冲液为醋酸盐缓冲液 (pH3. 5)，缓冲液用量与卡贝缩宫素的乙酸溶液的比例为30~40:1。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中，所述的反向色谱法进行纯化，纯化 的具体色谱条件为： 色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，柱子直径和长度为50mmX250mm 流动相：A: 1%冰醋酸水溶液 B:乙腊 检测波长：230nm '流速：80ml/min 洗脱梯度：〇5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5中，所述的浓缩条件为蒸馈溫度小于 60°C，真空度为 0. 085~0. 095Mpa。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5中，所述的冷冻干燥，具体操作过程 为：预冻至-45~-40°C后保溫化，开真空累抽真空并使真空度恒定在lOOKPaW下，期间自 然升溫，真空干燥12h。
【专利摘要】本发明公开了一种合成卡贝缩宫素的纯化方法，该方法包括了采用半透膜透析纯化与反相色谱纯化相结合的纯化方案，最终得到了纯度大于99.5%的卡贝缩宫素。半透膜透析纯化操作简单，无需特殊设备，半透膜可重复使用，有利于降低成本。同时，采用半透膜技术进行初步纯化，无需浓缩即可进行色谱纯化，减少高温浓缩步骤，降低多肽高温降解几率，确保收率和纯度。
【IPC分类】C07K1/20, C07K1/34, C07K1/36, C07K7/16
【公开号】CN105399799
【申请号】CN201511014180
【发明人】毛影, 李运铎, 李沁沁, 朱赞梅, 张佳美, 娄丽丽
【申请人】郑州大明药物科技有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月31日