一种使用漆酶催化合成水飞蓟宾的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种使用漆酶催化合成水飞蓟宾的方法，属于生物化工领域。
【背景技术】
[0002] 水飞蓟素（Silymarin)是从菊科植物水飞蓟（Silybum marianum Linn. Gaertn) 中提取出的一种黄酮类化合物，具有多种临床功效，已被多国药典收录。水飞蓟宾（Silybin 或Silibinin)是水飞蓟素的4种异构体中含量最高，活性最好的1种，由一分子黄杉素 (Taxifolin)和一分子松柏醇（Coniferyl alcohol)通过氧化偶合而成。
[0003]目前，人们获取水飞蓟宾的主要手段是从水飞蓟种子中提取。然而，该提取工艺复 杂，成本较高；水飞蓟的生长收到季节和环境的影响，且占用耕地；提取过程中使用有机溶 剂等，产品的安全性受到威胁。近年来，有人通过金属离子（Ag 2O等）催化的方法，以松柏 醇和黄杉素为底物合成了水飞蓟宾的4种同分异构体。然而，该合成过程依然是在有机溶 剂中进行的，且反应时间较长（96h)。
【发明内容】
[0004] 为了克服上述问题，本发明提供了一种使用漆酶催化合成水飞蓟宾的方法，以漆 酶作为催化剂，以黄杉素、松柏醇作为底物，即可实现水飞蓟宾的合成，是一种安全高效的 方法。
[0005] 所述的漆酶，为一种铜蛋白，属于多酚氧化酶，以分子氧为电子受体来催化底物氧 化，能够氧化多种有机和无机化合物。
[0006] 所述的漆酶来源于漆树（Rhus vernicifera)，但不仅限于漆树。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述漆酶浓度为0. 267U/mL。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述底物黄杉素、松柏醇的摩尔比为1 :1。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述底物黄杉素浓度为2. 775 X 10 5M。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述催化是在适合漆酶催化反应的温度、PH条件下 进行。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述催化是在pH 3. ο-pH 8. 0条件下进行。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，反应体系的pH为6.0,通过添加 pH缓冲液控制pH。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述催化是在温度25°C下进行。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述催化反应的反应介质为水溶液。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述催化使用的反应介质是磷酸盐缓冲液，以 NaH2P04/Na2HP0#lW液控制 pH。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，反应介质是0. 2M的pH6的磷酸盐缓冲液。
[0017] 所述方法具体是：以pH 6. 0的磷酸缓冲液为反应介质，底物松柏醇、黄杉素的摩 尔比为1:1，酶的用量为0. 267U/mL，在25°C条件下反应。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，松柏醇、黄杉素的摩尔浓度为2. 775X 10 5M,酶的终 浓度为0. 267U/mL，以pH6. O的0. 2M磷酸缓冲液为反应介质。在25°C条件下反应lh，水飞 蓟宾的产量达到〇. 9694mg/L。反应产物为水飞蓟宾的4种同分异构体（水飞蓟宾A、异水 飞蓟宾A、水飞蓟宾B和异水飞蓟宾B)。
[0019] 本发明的有益之处：
[0020] 本发明提供了一种新的合成水飞蓟宾的方法，用酶量低、pH和温度范围广，不需要 额外添加其他物质，反应简便易控，产物分离纯化简单，安全性高。本发明使用漆酶催化合 成水飞蓟宾，可以在水相介质、常温条件下迅速反应，克服了传统的金属离子催化水飞蓟宾 合成反应所存在的反应时间长（96h)和温度高（75°C )导致的能耗高、效率低的缺陷，以及 必须使用有机溶剂导致的成本高、安全性不足等缺陷。使用本发明方法，在25°C条件下，Ih 之内即可生成0. 9694mg/L水飞蓟宾（4种水飞蓟宾同分异构体的总和，下同）。
【附图说明】
[0021] 图1 :阴离子模式下水飞蓟宾的质谱图；其中，481. 1140m/z为在阴离子模式下，水 飞蓟宾脱氢的同位素峰之一；
[0022] 图2 :Formula Predictor预测和实测的水飞蓟宾同位素峰；其中，A为 C25H22O10[M-H] :predicted region for 481. 1140m/z ；B 为 measured region for 481.1140m/z ；
[0023] 图3 :漆酶催化松柏醇和黄杉素合成水飞蓟宾反应体系的色谱图；其中，8、9、10、 11分别为水飞蓟宾的4种同分异构体；
[0024] 图4 :漆酶催化水飞蓟宾合成的反应动力学曲线。
【具体实施方式】
[0025] 材料与方法
[0026] 松柏醇、黄杉素、水飞蓟宾标准品和漆酶（Laccase, from Rhus vernicifera)购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。松柏醇、黄杉素和水飞蓟宾溶于甲醇（Sigma-Aldrich, HPLC grade)，配制成lg/L的标准品。
[0027] 0. 2M 磷酸钠缓冲液（PBS, pH6. 0):将 0. 2M 的 Na2HPOjP 0. 2M 的 NaH 2P04按照 12. 3:87. 7(v/v)的比例混合。将缓冲液于冰上保存，使用前于25°C平衡。
[0028] 准确称取一定质量的松柏醇和黄杉素，分别以0. 2M PBS(pH6. 0)溶解并定容至 0. 555mM和0. 2774mM。以0. 2M PBS(pH6. 0)将漆酶溶解为5. 335U/mL。松柏醇和黄杉素溶 液于4°C避光保存，漆酶溶液于_20°C避光保存，使用前在冰上溶解。反应在黑暗条件下、 25°C金属浴中进行，反应结束后立即加入一定体积的甲醇终止酶反应，并置于冰上、避光， 直到进样分析。
[0029] 产物水飞蓟宾的鉴定使用SHIMADZU UPLC-MS-IT-T0F进行：
[0030] (1)流动相A :0.1 % (v/v)甲酸，流动相B :100%甲醇；洗脱梯度（以流动相B 的百分比表示）：〇min 30%、30.00min 55%、35.00min 55%、40min 30%;总流速 0.2mL/ min ;紫外检测器，检测波长288nm ;柱温箱温度40°C ;质谱设置为阴离子模式，采集范围 100-700m/z，离子富集时间10. 00msec，重复次数3,检测器电压：相对于调谐电压。进样体 积 10 μ L。
[0031] (2)分别准确配制2· 5、5· 0、10、20、40、80、100mg/L的水飞蓟宾标准品。标准品的 分析方法与样品的分析方法相同。以标准品的浓度作为纵坐标，以相应提取离子流（m/z = 481. 1140)的峰面积作为横坐标，绘制标准曲线。以阴离子模式下，样品提取粒子流（m/z = 481. 1140)的峰面积，通过标准曲线方程计算样品中水飞蓟宾的浓度。
[0032] 实施例1
[0033] 为了验证漆酶催化松柏醇和黄杉素合成水飞蓟宾的能力，以松柏醇和黄杉素作为 底物，由漆酶（Laccase)催化水飞蓟宾的合成。分别验证了省却底物或酶时，水飞蓟宾的产 生情况，如表1所示。
[0034] 准确称取一定质量的松柏醇和黄杉素，分别以0. 2M PBS(pH6. 0)溶解并定容至 0. 555mM和0. 2774mM。以0. 2M PBS(pH6. 0)将漆酶溶解为5. 335U/mL。松柏醇和黄杉素溶 液于4°C避光保存，漆酶溶液于_20°C保存，使用前在冰上溶解。反应在25°C避光条件下进 行，反应时间为lh。反应结束后立即加入100 μ L甲醇以终止酶反应，并置于冰上、避光，直 到进样分析。所有反应均进行3次，取平均值。
[0035] 表1漆酶催化水飞蓟宾合成的验证
[0038] *MeOH在反应结束后添加，用以终止酶促反应。
[0039] 以2. 5、5. 0、10、20、40、80、100mg/L的水飞蓟宾标准品绘制标准曲线，得到的标准 曲线的线性相关性R2= 0. 9993。以阴离子模式下，得到样品提取粒子流（m/z = 481. 1140) 的峰面积，通过标准曲线方程计算样品中水飞蓟宾的浓度。结果表明，阴离子模式下，水飞 蓟宾4种同分异构体的核质比均为481. 1140m/z，质谱图如图1、图2所示，色谱图如图3所 示。反应2在阴离子模式下提取离子流（481. 1140m/z)有响应，但信号极低，无法进行定量 分析。反应3和反应4中，提取粒子流（m/z = 481. 1140)没有响应。同时，反应1中水飞 蓟宾的产量为〇. 9694mg/L。
[0040] 以上结果表明，漆酶能够催化松柏醇和黄杉素合成水飞蓟宾，Ih内产量可达到 0. 9694mg/L。松柏醇和黄杉素也可以自发地合成水飞蓟宾，但自发反应效率极低，以至于达 不到定量分析的下限。在缺少底物黄杉素或松柏醇的条件下，不能合成水飞蓟宾。
[0041] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种使用漆酶催化合成水飞蓟宾的方法，其特征在于，所述方法是以漆酶作为催化 剂，以黄杉素、松柏醇作为底物，催化合成水飞蓟宾。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，催化是在适合漆酶催化反应的温度、pH条 件下进行。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述漆酶浓度为0. 267U/mL。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物黄杉素、松柏醇的摩尔比为1 :1。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化合成反应的反应介质为水溶液。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化是在pH3.Ο-pH8. 0条件下进 行。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述催化使用的反应介质是磷酸盐缓冲 液，以NaH2P04/Na2HP04缓冲对控制pH。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：以pH6. 0的磷酸缓冲 液为反应介质，底物松柏醇、黄杉素的摩尔比为1:1，酶的用量为0.267U/mL，在25 °C条件 下反应。9. 根据权利要求1-9任一所述方法得到的水飞蓟宾。
【专利摘要】本发明公开了一种使用漆酶催化合成水飞蓟宾的方法，属于生物化工领域。本发明以漆酶催化松柏醇和黄杉素合成了水飞蓟宾的4种同分异构体。该反应在水相中进行，避免了有机溶剂的使用；反应的效率较高，在1h内即可生成0.9694mg/L水飞蓟宾。该方法是一种安全且高效的合成水飞蓟宾合成方法。
【IPC分类】C12P17/16
【公开号】CN105400843
【申请号】CN201510816624
【发明人】周景文, 陈坚, 吕永坤, 堵国成
【申请人】江南大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月20日