一种促重组毕赤酵母表达木聚糖酶的培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于木聚糖酶制品生产技术领域，尤其是涉及一种促重组毕赤酵母表达木聚糖酶的培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002]巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)是最广泛应用的重组蛋白生产菌之一。具有翻译后修饰、遗传操作相对简单、消除了内毒素和噬菌体污染、表达水平高、产物可分泌和利用简单无机盐培养基就可进行高密度发酵等优点。
[0003]木聚糖酶是常用的工业用酶之一，在医药、保健品、食品、饲料和新能源等领域都有重要应用。目前木聚糖酶主要由重组毕赤酵母进行表达生产。
[0004]目前实验室常用的重组毕赤酵母诱导培养基主要是经典的BMMY培养基，但该培养基成分复杂、原料价格昂贵、培养过程不易控制及实验重复性差，因此不适用于大规模工业化生产。当前重组毕赤酵母大规模工业化生产主要使用合成培养基。然而，目前重组毕赤酵母最常用的合成培养基一 BSM和FM22等一在初始pH高于5.5时易出现金属沉淀，而大部分毕赤酵母重组蛋白的发酵过程中pH在5.5-7.0之间变化，所以BSM和FM22等培养基不利于重组酵母的生长与异源蛋白的表达。因此开发出成分简单而又明确、成本低和不易出现金属沉淀的合成培养基，用于木聚糖酶的表达与生产是推动该酶的产业化生产的重要条件。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种促重组毕赤酵母表达木聚糖酶的培养基及其制备方法，以解决现有重组毕赤酵母表达木聚糖酶的复合培养基成分复杂、原料价格昂贵、生产条件不易控制及合成培养基初始pH偏低易出现沉淀而影响细胞的生长和外源蛋白的表达等问题，本发明提供一种成分明确、高效、简便、廉价和安全的，适于重组毕赤酵母表达木聚糖酶基础研究和商业化生产的合成培养基，以及该培养基的制备方法。
[0006]本发明的技术方案是:一种促重组毕赤酵母表达木聚糖酶的培养基，包括以下组分:甘油磷酸钠15.0?40.0g，硫酸铵1.0?10.0g，二水合硫酸钙1.0?4.0g，硫酸钾8.0?16.0g,七水合硫酸镁7.0?15.0g，PTM1微量元素溶液0.5?6.0mL，无水甲醇5.0?20.0mL，吐温801.0?3.0g，蒸馏水溶解至1000mL，用Κ0Η调pH在5.5?7.5之间。
[0007]本发明的另一方面，还包括上述培养基在重组毕赤酵母GS115表达来源于黑曲霉XZ-3S的木聚糖酶基因xynZF-2基因表达的木聚糖酶方面的应用。
[0008]本发明的另一方面还包括上述培养基的制备工艺，包括以下步骤:
[0009](1)配制基础培养基:按照上述培养基配方，配制包含甘油磷酸钠、硫酸铵、二水合硫酸钙、硫酸钾、七水合硫酸镁的基础盐培养基，并以蒸馏水定容，用Κ0Η调pH在5.5?7.5之间，121°C灭菌15min，冷却备用。
[0010](2)添加微量元素PTM1:按照上述配方中所述PTM1的配比，对PTM1微量元素进行过滤除菌，然后无菌加入步骤(1)中所述基础盐培养基。
[0011](3)添加诱导剂无水甲醇:按照上述配方中所述无水甲醇的配比，在重组毕赤酵母表达木聚糖酶的发酵过程中，每12h加入无水甲醇进行诱导表达，即制成用于促进重组毕赤酵母表达木聚糖酶的培养基。
[0012]步骤(2)中PTM1 的成分含量分别为:CuS04.5H20 6.0g/L，KI 0.08g/L，MnS〇4.H203.0g/L,Na2Mo04.2H20 0.2g/L，H3B030.02g/L，CoCl2.6H2O 0.5g/L，ZnCl220.0g/L，FeS04.7H20 65.0g/L，生物素0.2g/L，浓H2SO45.0ml。
[0013]本发明具有的优点和积极效果是:
[0014]1、本发明以市售无机盐为主要原料，成分明确，价格经济。
[0015]2、重组毕赤酵母在该培养基中生长良好，在最佳摇瓶生长状态下，菌体生物量、木聚糖酶酶活和比酶活的最高值分别可达到21.0g/L(细胞干重)、6500.0U/mL(改进的DNS法，BAILEY M J，BIELY P and POUTANEN K.1nterlaboratory testing of methods forassay ofxylanase activity[J].Journal ofB1technology，1992，23:257-270.)和21700.0U/mg(用Bradford法测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白作为标准蛋白，酶的比活性(U/mg)=酶活性/蛋白浓度)以上，生物量比经典合成培养基BSM和FM22的培养效果均提高50.0%以上，而木聚糖酶酶活和比酶活均分别提高10倍以上，且超越实验室使用价格高昂的复合培养基BMMY的培养效果。
[0016]3、可广泛应用于重组毕赤酵母表达木聚糖酶的基础研究和工业化生产，尤其适用于工业化大规模表达木聚糖酶。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
[0018]本实施例的重组毕赤酵母GS115表达木聚糖酶诱导培养基的配方组成为:甘油磷酸钠29.0g，硫酸铵4.5g，二水合硫酸钙1.6g，硫酸钾14.0g，七水合硫酸镁11.0g，PTM1微量元素溶液2.4mL，无水甲醇10.0mL，吐温802.0g，蒸馏水溶解至1000.0mL，用Κ0Η调pH在7.0。
[0019]该培养基的制备方法为:
[0020](1)基础合成培养基制备:秤取甘油磷酸钠29.0g，硫酸铵4.5g，二水合硫酸钙
1.6g，硫酸钾14.0g，七水合硫酸镁11.0g，吐温802.0g，混勾后加蒸馈水定容至1000mL，用Κ0Η调pH在7.0，121°C灭菌20分钟，冷却后即得基础合成培养基。
[0021](2)添加微量元素PTM1:对2.4mL PTM1微量元素进行过滤除菌，然后无菌加入步骤(1)中所述基础盐培养基。
[0022](3)添加诱导剂无水甲醇:在重组毕赤酵母表达木聚糖酶的发酵过程中，每12h加入10mL/L的无水甲醇进行诱导表达，即制成用于促进重组毕赤酵母表达木聚糖酶的诱导培养基。
[0023]重组毕赤酵母经YPD培养基复活活化后，以1% (V/V)接种量接入FM22生长培养基中，培养Id后静置培养液以沉淀菌体，并把菌体转入本实施例所制备的诱导培养基中，30°C，240r/min摇瓶震荡培养5d后生物量、木聚糖酶酶活和比酶活分别可达19.3g/L(细胞干重)、5500.0U/mL和15500.0U/mg。
[0024]实施例2
[0025]重组毕赤酵母GS115表达木聚糖酶诱导培养基的配方组成为:甘油磷酸钠28.0g，硫酸铵3.5g，二水合硫酸钙2.5g，硫酸钾10.0g，七水合硫酸镁10.0g，PTM1微量元素溶液
4.8mL，无水甲醇12.0mL，吐温802.8g，蒸馏水溶解至1000.0mL，用K0H调pH在7.5。
[0026]该培养基的制备方法为:
[0027](1)基础合成培养基制备:秤取甘油磷酸钠28.0g，硫酸铵3.5g，二水合硫酸钙
2.5g，硫酸钾10.0g，七水合硫酸镁10.0g，吐温802.8g，混匀后加蒸馏水定容至1000mL，用Κ0Η调pH在7.5，121°C灭菌20分钟，冷却后即得基础合成培养基。
[0028](2)添加微量元素PTM1:对4.8mL PTM1微量元素进行过滤除菌，然后无菌加入步骤(1)中所述基础盐培养基。
[0029](3)添加诱导剂无水甲醇:在重组毕赤酵母表达木聚糖酶的发酵工程中，每12h加入10mL/L的无水甲醇进行诱导表达，即制成用于促进重组毕赤酵母表达木聚糖酶的诱导培养基。
[0030]重组毕赤酵母经YPD培养基复活活化后，以1% (V/V)接种量接入FM22生长培养基中，培养Id后静置培养液以沉淀菌体，并把菌体转入本实施例所制备的诱导培养基中，30°C，240r/min摇瓶震荡培养5d后生物量、木聚糖酶酶活和比酶活分别可达20.3g/L(细胞干重)、6300.0U/mL和16400.0U/mg。
[0031]实施例3
[0032]重组毕赤酵母GS115表达木聚糖酶诱导培养基的配方组成为:甘油磷酸钠30.0g，硫酸铵7.0g，二水合硫酸钙1.6g，硫酸钾14.0g，七水合硫酸镁11.0g,PTM1微量元素溶液
2.8mL，无水甲醇10.0mL，吐温802.3g，蒸馏水溶解至1000.0mL，用Κ0Η调pH在7.0。
[0033]该培养基的制备方法为:
[0034](1)基础合成培养基制备:秤取甘油磷酸钠30.0g，硫酸铵7.0g，二水合硫酸钙
1.6g，硫酸钾14.0g，七水合硫酸镁11.0g，吐温802.3g，混勾后加蒸馈水定容至1000mL，用Κ0Η调pH在7.0，121°C灭菌20分钟，冷却后即得基础合成培养基。
[0035](2)添加微量元素PTM1:对2.8mL PTM1微量元素进行过滤除菌，然后无菌加入步骤
(1)中所述基础盐培养基。
[0036](3)添加诱导剂无水甲醇:在重组毕赤酵母表达木聚糖酶的发酵工程中，每12h加入10mL/L的无水甲醇进行诱导表达，即制成用于促进重组毕赤酵母表达木聚糖酶的诱导培养基。
[0037]重组毕赤酵母经YPD培养基复活活化后，以1% (V/V)接种量接入FM22生长培养基中，培养Id后静置培养液沉淀菌体，并把菌体转入本实施例所制备的诱导培养基中，30°C，240r/min摇瓶震荡培养5d后生物量、木聚糖酶酶活和比酶活分别可达21.08/1(细胞干重)、6500.0U/mL和21700.0U/mg。
[0038]以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【主权项】
1.一种促重组毕赤酵母表达木聚糖酶的培养基，其特征在于:包括以下组分:甘油磷酸钠15.0?40.0g，硫酸铵1.0?10.0g，二水合硫酸钙1.0?4.0g，硫酸钾8.0?16.0g，七水合硫酸镁7.0?15.0g，PTM1微量元素溶液0.5?6.0mL，无水甲醇5.0?20.0mL，吐温801.0 —3.0g，蒸馏水溶解至1000mL，用K0H调pH在5.5?7.5之间。2.—种如权利要求1所述的促重组毕赤酵母表达木聚糖酶的培养基的制备工艺，其特征在于:包括以下步骤: (1)配制基础培养基:按照所述培养基配方，配制包含甘油磷酸钠、硫酸铵、二水合硫酸钙、硫酸钾、七水合硫酸镁的基础盐培养基，并以蒸馏水定容，用K0H调pH在5.5?7.5之间，121°C灭菌15min，冷却备用。 (2)添加微量元素PTM1:按照所述培养基配方中的所述PTM1的配比，对PTM1微量元素进行过滤除菌，然后无菌加入步骤(1)中所述基础盐培养基。 (3)添加诱导剂无水甲醇:按照所述培养基配方中的所述无水甲醇的配比，在重组毕赤酵母表达木聚糖酶的发酵过程中，每12h加入无水甲醇进行诱导表达，即制成用于促进重组毕赤酵母表达木聚糖酶的培养基。3.—种如权利要求1所述的培养基在重组毕赤酵母GS115表达木聚糖酶基因xynZF-2基因表达的木聚糖酶上的应用。
【专利摘要】本发明提供一种促重组毕赤酵母表达木聚糖酶的培养基及其制备方法，培养基包括以下组分：甘油磷酸钠15.0～40.0g，硫酸铵1.0～10.0g，二水合硫酸钙1.0～4.0g，硫酸钾8.0～16.0g，七水合硫酸镁7.0～15.0g，PTM1微量元素溶液0.5～6.0mL，无水甲醇5.0～20.0mL，吐温801.0～3.0g，蒸馏水溶解至1000mL，用KOH调pH在5.5～7.5之间。本发明的有益效果是成分明确，价格经济，重组毕赤酵母在该培养基中生长良好，适用于工业化大规模表达木聚糖酶。
【IPC分类】C12N9/42, C12R1/84
【公开号】CN105420219
【申请号】CN201610053430
【发明人】朱新术, 赵文慧, 周晨妍, 罗晓秋, 解丽芹, 李同彪
【申请人】新乡医学院
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2016年1月26日