一种源于极端抗盐碱曲霉的纤维素酶基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物工程和酶工程技术领域，具体涉及一种纤维素酶及其编码基因、含 有编码基因的重组载体、基因工程菌株以及其生物学活性和应用。
【背景技术】
[0002] 纤维素酶是一种高活性生物催化剂，是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总 称，包括三类酶，即外切B-1，4-葡聚糖苷酶（简称CBH)、内切B-1，4-葡聚糖苷酶（简称EG) 和B-1，4-葡萄糖苷酶（简称BG)，在这3种酶的协同作用下，纤维素最终被分解成葡萄糖。
[0003] 纤维素类物质是自然界中最丰富的一种可再生资源。生物资源是可再生性资源， 地球上每年光合作用的产物高达1. 5X10n_2.OX10nt，是人类社会赖以生存的基本物质 来源，其中90%以上为木质纤维素类物质，其中的纤维素是地球上最丰富的多糖物质，这类 物质是植物细胞壁的主要成分。据报道，我国的纤维素类资源极为丰富，仅秸杆和皮壳每年 可达7X10s吨。但是这些物质的利用率却很低，多采用燃烧的方法处理，这样不仅造成了 环境污染，也是资源和能源的巨大浪费。随着世界人口迅速增长、粮食、矿产资源日渐枯竭， 开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类 急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料绿色化，具有极其重大的现实意义和光明的发展 前景。
[0004] 自从纤维素酶被人类认识和利用以来，在食品、饲料、酿酒、纺织、中药提取和造纸 等众多的工业领域都有着广泛的应用价值。当前，人们在研究纤维素酶过程中认识到，提高 酶产量、活力和稳定性，将在应用中显现巨大的优势。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种酶活力高和稳定性强的纤维素酶，及其编码基因、重组 载体、基因工程菌株及其应用。
[0006] 本发明采用的技术方案如下：
[0007] 本发明从极端抗盐碱曲霉CCHA获得一种纤维素酶基因的全长cDNA，命名为 CCHA333〇
[0008] 该基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，该基因序列长度为1509bp，编码502个 氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发 现属于糖苷水解酶第5家族，该酶含有一个纤维素结合位点。
[0009] 构建含有纤维素酶基因CCHA333序列的重组表达质粒载体pPIC9K-CCHA333,利用 电转仪进行电击转化PIChiapastoriSGsll5,在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳 性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母重组基因工程菌 株GS115-pPIC9K-CCHA333。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28°C、200rpm/min摇床 培养2d后，以5:1比例浓缩转接于BMMY培养基中，在25°C、200rpm/min摇床培养诱导表达 2d后，纤维素酶产量达0. 2mg/ml。本发明的纤维素酶水解羧甲基纤维素钠实验中，最适pH 值为6,最适酶反应温度为55°C。酶在pH范围4-12,温度80°C加热2h，酶活性能保持50% 以上，具有较高的热稳定性。在众多金属离子存在环境下，酶活性明显提高，在ImMCo2+和 Cu2+浓度环境下，酶活性提高分别为1. 95倍和1. 53倍，在500mMNa2+浓度环境下酶活性提 高2. 15倍。在分解玉米秸杆的试验中，每0. 05g玉米秸杆粉可产生0. 253mg葡萄糖。
[0010] 通过构建重组载体并在毕赤酵母中超量表达的产物具有高效的水解羧甲基纤维 素钠和玉米秸杆的功能，本发明的纤维素酶及其编码基因在纤维素降解中可广泛应用。
【附图说明】
[0011] 图1为纤维素酶SDS-PAGE凝胶电泳图
[0012] 图2为纤维素酶水解羧甲基纤维素钠的最适酶反应温度示意图
[0013] 图3为纤维素酶水解羧甲基纤维素钠的最适pH值的测定结果示意图
[0014] 图4为纤维素酶热稳定性的测定结果示意图
[0015] 图5为纤维素酶pH稳定性的测定结果示意图
[0016] 图6为纤维素酶在不同金属离子环境下酶活性的测定结果示意图
[0017] 图7为纤维素酶在NaCl环境下酶活性的测定结果示意图
[0018] 图8为纤维素酶在Co2+环境下酶活性的测定结果示意图
[0019] 图9为纤维素酶水解玉米秸杆前后葡萄糖产量测定结果示意图
【具体实施方式】
[0020] 实施例1:极端耐盐曲霉CCHA的cDNA合成
[0021] (1)极端耐盐曲霉CCHA总RNA的提取：参照TriZol试剂盒说明。
[0022] (2)cDNA链的合成：按照Takara公司的TaKaRaRNAPCRkit(AMV)Ver3. 0 试剂盒说 明书进行：取l_2yg总RNA，加RnaseFreeddH20至9. 5yL，将RNA样品在75°C变性5min， 立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分：10mmol/L dNTPMixture2yL, 10XRTBuffer(Mg2+) 2μL, 25mmol/LMgcl24μL, 01igod(T)-Adaptor PrimerlμL，RnaseInhibiter0. 5μL,AMVReverseTranseriptase1μL(FinalVolume 20μL)，将反应液混合后，室温下放10min，然后42°C温育60min，再煮沸5min以灭活反转录 酶。加入180yLDEPC处理的ddH20,稀释至200yL，混勾，稍微离心，-20°C保存，备用。
[0023] 实施例2:纤维素酶基因CCHA333的克隆与表达载体的构建
[0024] (1)引物设计：根据纤维素酶基因同源序列的保守区，结合所用载体设计引物，在 引物的5'端分别引入EcoRI和NotI酶切位点（下划线部分）：
[0025]上游引物：5' -CCGGAATTCATGAGATTCACCAGTTTG(SEQIDNO. 3)
[0026]下游引物：5'-TTGCGGCCGCAATCACTGGCACTGT(SEQIDNO. 4)
[0027] (3)PCR扩增：以极端耐盐曲霉CCHAcDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系 (25μL)如下：
[0028] 10XExTagBuffer2. 5μL，2. 5mmol/L的dNTPsmixture1μL，10μmol/L的上 下游引物各1μL，ExTagDNA扩增酶0. 5μL，模板10-100ng，无菌去离子水18μL。PCR扩 增条件：94°C预变性 3min;94°C30s，50°C30s，72°C90s，共 30 个循环；72°C再延伸 10min。 利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。
[0029] (4)表达载体的构建：纯化后的PCR产物连接到pMD_18TVector，转化E.coli DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性重组质粒并测序。利用EcoRI和NotI将目的基因和 PPIC9K载体分别双酶切后进行连接，连接产物转化E.coliDH5a感受态细胞，PCR筛选阳 性重组质粒并提取重组质粒。经酶切验证的重组质粒（PPIC9K-CCHA333)测序确认表达载 体构建正确。
[0030] 实施例3:表达纤维素酶基因CCHA333的酵母工程菌株的构建、筛选与诱导表达
[0031] (1)重组表达质粒的线性化：将重组表达质粒PPIC9K-CCHA333用限制性内切酶 SalI线性化。
[0032] (2)转化：电击转化酵母菌株PichiapastoriSGS115酵母感受态细胞，转化方法参 见工nvitrogen公司毕赤酵母操作手册。
[0033] (3)筛选：用灭菌牙签挑取转化子对应点种在MM和MD平板上，30°C培养2-4d，挑 取在MD/MM平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子分别点种于lmg/ mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mLG418的YPD平板上筛选多拷贝转化子。
[0034] (4)诱导表达：工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28°C、200rpm/min摇床培养 2d后，以5:1比例浓缩转接于BMMY培养基中，在25°C、200rpm/min摇床培养诱导表达2d， 每12h补充甲醇终浓度为1%，每12h取样，12000rmp/min离心5min，取上清进行SDS-PAGE 凝胶电泳分析。
[0035] 实施例4:纤维素酶活性测定
[0036] (1)没活力单位的定义：lmL液体酶在最适酶反应条件下，每分钟水解羧甲基纤维 素钠产生1μg葡萄糖，为一个酶活力单位（U/mL)。
[0037] (2)酶活性测定方法：酶活性测定采用DNS法，蛋白含量测定采用Bradford法。
[0038] (3)纤维素酶的最适反应温度、最适pH及热稳定性和pH的测定：诱导表达的纤维 素酶经过DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析，获得电泳均一的纯化蛋白，用纯化的纤维素 酶测定其性质。分别在20-90°C，梯度为10°C的温度和pH3-11，梯度为1的pH条件下测定 纤维素酶的酶活力。将纤维素酶在不同的温度（60°C和80°C)下保温不同的时间（lh，2h， 3h，4h)后和在不同pH(3-12)缓冲液下4°C放置12h后，分别测定剩余酶活力。
[0039] (4)纤维素酶在不同金属离子中酶活力的测定：分别在终浓度为lmmol的Co2+、 Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg'Mn2+、Ba2+、Ni2+、EDTA中测定纤维素酶的酶活力。分别在不同Co2+离子 浓度和不用Na+离子浓下测定纤维素酶的酶活力。
[0040] 实施例5:纤维素酶水解玉米秸杆的应用
[0041] (1)玉米秸杆样本的制备：将粉碎过的玉米秸杆用蒸馏水冲洗干净，加入1. 0%的 稀硫酸，于120 °C下保温2h。取出后过滤至滤出液呈中性，将玉米秸杆残渣于75 °C下烘24h， 待试样品。
[0042] 纤维素酶水解玉米秸杆：取0. 05g待试样品放入400μL的pH为5的缓冲液中，加 入100μL的纤维素酶液，在纤维素酶的最适温度条件下进行反应30min。对照取0. 05g待 试样品放入400μL的pH为5的缓冲液中，加入100μL的蒸馏水，在纤维素酶的最适温度 条件下进行反应30min。反应完毕，将水解物过滤，测定滤出液中还原糖的含量。
[0043]
【主权项】
1. 一种纤维素酶基因CCHA333,其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。2. 按权利要求1所述的纤维素酶基因CCHA333,其特征在于所述纤维素酶基因CCHA333 的编码序列如SEQIDNO. 2所示。3. -种重组载体，以及重组载体转化得到的重组基因工程菌，其特征在于含有权利要 求2所述的纤维素酶基因CCHA333的编码序列。4. 一种权利要求1所述的纤维素酶基因CCHA333的应用，其特征在于作为水解羧甲基 纤维素钠的酶动力学特性鉴定。5. 权利要求1所述的纤维素酶基因CCHA333在纤维素降解中的应用。
【专利摘要】一种源于极端抗盐碱曲霉的纤维素酶基因及应用属生物工程和酶工程技术领域，本发明公开的纤维素酶基因CCHA333的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；纤维素酶基因CCHA333的编码序列如SEQ？ID？NO.2所示；纤维素酶基因CCHA333可在水解羧甲基纤维素钠的酶动力学特性鉴定中应用；纤维素酶最适pH值为6，最适酶反应温度为55℃，在pH范围4-12，温度80℃加热2h，酶活性能保持50％以上。在众多金属离子存在环境下，酶活性明显提高，如Cu2+，Co2+和Na2+。通过构建重组载体并在毕赤酵母中超量表达的产物具有高效的水解羧甲基纤维素钠和玉米秸秆的功能，本发明的纤维素酶及其编码基因可广泛应用于纤维素降解。CGMCC602520120420
【IPC分类】C12P19/14, C12N1/19, C12N9/42, C12R1/84, C12N15/81, C12N15/56
【公开号】CN105420259
【申请号】CN201610005024
【发明人】张世宏, 李正群, 魏毅, 陈丽娜, 刘少帅, 周晓阳, 宋妍悦, 裴雪
【申请人】吉林大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2016年1月6日