过程中用于合成其它聚合物和大分子的固有属性，所述聚合物和大分子具有 限定序列的核苷酸（即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定序列的氨基酸，以及由此而得的生物属 性。因此，如果由基因产生的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生了蛋白质，则 所述基因编码所述蛋白质。本领域技术人员理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核 苷酸和核酸可以编码相同的多肽。还应当理解，技术人员可使用常规技术制备不影响本文 所述多核苷酸所编码的多肽序列的核苷酸取代，这反映了待表达所述多肽的任何具体宿主 生物体的密码子使用。因此，除非另外指明，"编码氨基酸序列的核苷酸序列"包括互为简并 版本并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包 括内含子。
[0038] 术语"重组多肽"是指具有非天然结合在一起的序列的多核苷酸或核酸。重组核酸 可以载体的形式存在。"载体"可含有给定的目的核苷酸序列和调节序列。载体可被用于表 达给定核苷酸序列或维持给定的核苷酸序列以便复制、操纵它或在不同位置之间（例如，不 同生物体之间）转移它。载体可以被引入合适的宿主细胞中以用于上述目的。
[0039] 如本文所用，术语"可操作地连接"可指当合适的分子(如转录因子)结合到表达控 制序列时，以能够表达多核苷酸的方式将多核苷酸连接到表达控制序列。
[0040] 如本文所用，术语"表达控制序列"或"调控序列"是指在某种宿主细胞中调节可操 作连接的核酸序列表达的DNA序列。
[0041 ]载体的实例包括，但不限于质粒、粘粒、噬菌体、YAC或PAC。通常情况下，在载体中， 给定的核苷酸序列被可操作地连接到调控序列，使得当载体被引入宿主细胞时，给定的核 苷酸序列可以在宿主细胞中在调控序列的控制下表达。调节序列可以包括，例如但不限于， 启动子序列（例如，巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、T7启动子、以 及醇氧化酶基因（A0X1)启动子）、起始密码子、复制起点、增强子、操纵基因序列、分泌信号 序列（例如，α-交配因子信号）和其他控制序列（例如，Shine-Dalgarno序列和终止序列）。 优选地，载体可进一步含有标记序列(例如，抗生素抗性标记的序列）用于后续的筛选程序。 为蛋白质生产的目的，在载体中，给定的感兴趣核苷酸序列可以连接到另一核苷酸序列而 不是上述调节序列，从而产生融合多肽并有利于随后的纯化程序。所述融合多肽包括，但不 限于，His-标签融合多肽和GST融合多肽。
[0042]当表达载体是用于植物细胞的构建体时，可使用本领域中已知的几种合适启动 子，包括但不限于玄参花叶病毒35S启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、鸭跖草黄斑 驳病毒启动子、水稻胞质磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子、水稻肌动蛋白l(Actl)基因启动子、 泛素 (Ub i)启动子、水稻淀粉酶基因启动子、拟南芥的腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)启动 子、甘露碱合成酶和章鱼碱合成酶启动子。
[0043] 为了制备转基因植物，优选地如本文所使用的表达载体带有一个或多个选择标记 用于选择转化的植物，例如，赋予对以下抗生素抗性的基因，如潮霉素、氨苄青霉素、庆大霉 素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、新霉素、遗传霉素及四环素;URA3基因，赋予对任何其它有毒 化合物抗性的基因，如某些金属离子或除草剂，如草铵膦或双丙氨膦。
[0044] 如本文所用，术语"转基因植物"或"转基因系"是指含有重组核苷酸序列的植物。 转基因植物可从重组细胞中生长出。术语"植物"可包括植物的任何材料，包括植物的细胞 (包括愈伤组织，callus)、植物的任何部位或器官及子代。
[0045] 在本领域中可获得多种可用来工程化稳定的转基因植物的方法。在本发明的一个 实施方案中，通过用重组农杆菌(Agrobacterium)细胞转化植物的组织(如原生质体或植物 的叶盘），并从转化的植物组织产生整个植物来产生转基因植物，所述农杆菌细胞包含编码 如本文所述的铁调节多肽的多核苷酸。在另一个实施方案中，编码所需蛋白质的多核苷酸 可以通过基因枪技术被引入到植物，特别是如果使用重组农杆菌细胞的转化在植物中效率 不高时。
[0046] 术语"多肽"或"肽"是指过肽键连接的氨基酸残基组成的聚合物。
[0047] 为了确定两个氨基酸序列的百分比同一性，为了优化比较的目的，所述序列进行 比对(例如，可以在第一氨基酸序列的序列中引入间隙以优化与第二氨基酸序列的比对）。 在计算百分比同一性时，计数典型的精确匹配。确定两个序列之间的百分比同源性或同一 性可以使用本领域中已知的数学算法来实现，如BLAST和Gapped BLAST程序、NBLAST和 XBLAST程序、或ALIGN程序。
[0048]在本发明中，意外地发现，新的铁-调节多肽家族(其共享短C-末端氨基酸序列基 序，该基序在被子植物中许多的高度多样化的肽中是保守的）通过活化铁摄取基因可以启 动铁、锌和锰的积累，过表达这种铁-调节多肽(本文也称为IMA肽）的植物表现出一种或多 种微量元素，如铁、锌和/或锰的水平增加。操纵MA肽表达代表在可食用植物，如作物或果 树中铁生物强化的新策略。
[0049] 因此，在一个方面，本发明提供了使用重组多核苷酸转化的转基因植物，所述重组 多核苷酸包含编码如本文所描述的可操作地连接于表达控制序列的铁调节多肽的核苷酸 序列。
[0050] 根据本发明，如本文所述的铁-调节多肽包含C-末端基序，其从N-末端至C末端包 含
[0051 ] GDDDD(SEQ ID N0:1)的第一结构域，以及
[0052] DXAPAA(SEQIDN0:2)的第二结构域，
[0053] 其中第一结构域和所述第二结构域通过10个或更少氨基酸残基的肽间隔所连接， 以及其中铁调节多肽包括在长度上总计20至100的氨基酸残基。
[0054] 在一些实施方案中，本发明的铁调节多肽包括在长度上总计20至90、25至85、或45 至75的氨基酸残基。
[0055]如本文所使用的，术语铁调节多肽的"C末端基序"是指此基序更靠近铁调节多肽 的C末端而更远离N末端，优选地所述铁调节多肽结束以所述"C末端基序"结尾。典型地，在 线性氨基酸序列中，c-末端基序通常写在右侧。
[0056] 在一些具体实施方案中，本发明的铁调节多肽的第一结构域和所述第二结构域通 过具有总计1至6或1至3个任意氨基酸残基的肽间隔相连。
[0057] 在一些实施方案中，本发明的铁调节多肽的C末端基序包括选自以下的氨基酸序 列：
[0058] GDDDDSGYDYAPAA(SEQ ID NO:3)；
[0059] GDDDDDDCDVAPAA(SEQ ID N0:4);
[0060] GDDDDDDNGVIDVAPAA(SEQ ID NO:5)；
[0061] GDDDDDGGYDYAPAA(SEQ ID NO:6)；
[0062] ⑶DDDDDGGYDYAPAA(SEQ ID N0:7);
[0063] GDDDDDDYDCAPAA(SEQIDN0:8)jP
[0064] GDDDDDDVDVAPAA(SEQ ID N0:9)〇
[0065] 在一些实施方案中，本发明的铁调节多肽包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID N0s:25、26、27、63、65、74、75、98和99。
[0066] MMSFVANLAIKRFDHASTVYVEDVVDSSRVAYSENG⑶DDDSGYDYAPAA(基序SEQ ID NO: (SEQ ID N0:25)3)
[0067] MMSYVANLVIKSFDRASWYVEDWDSSRATCVENG⑶DDDSGYDYAPAA(基序SEQ ID NO: (SEQ ID N0:26)4)
[0068] MAVVSHNNAEGRLYESTQTWPIAYLQIGGQEN(SEQ ID NO:27)GGDDDDDDCDVAPAA(基序SEQ ID NO:5)
[0069] MWFICKEEYGVPLSNDWAATHEFGHKFCISNE⑶DDDDDNGVIDVAPAA(基序SEQ ID NO: (SEQ ID N0:63)6)
[0070] MWFLCKEEYGVLLGNDWAATHEFGHNFCISNE⑶DDDDDNGVIDVAPAA(基序SEQ ID NO: (SEQ ID N0:65)6)
[0071] MSFTSKVIALWCKKHGNDDGVDVYDAPAATA(SEQ ID NO:74)CIEGNVCNWHGDFVSFVPVALVEG DDDDDDGGYDYAPAA(基序SEQ ID NO:7)
[0072] MSFTSKVIAPWCKKHGNDDVVDAPAATTFIGG(SEQ ID NO:75)NVCNWHGDFVSFVPIAYMEGDDD DDGGYDYAPAA(基序SEQ ID NO:8)
[0073] MAPVSEASPLVHQDGGIIASFAVYAGAPCCSARGRMAETD迎画翌互匹基序SEQ(SEQ ID NO:98)ID NO:9)
[0074] MAIAKSECERLAWALLLESNLLVGNRRSNGD(SEQ ID NO: 99) JDDDDVDVAPAA(基序SEQ ID NO:10)
[0075] 具体地，如本文中所述的铁-调节多肽可以具有一个或多个生物活性，包括诱导铁 还原活性、或在植物中激活一种或多种用于铁稳态的转录因子，如AtbHLH38、AtbHLH39、 AtFIT或其任意组合。各种本领域中已知的方法可用于评估或确定这种本发明的铁调节多 肽的生物活性。
[0076] 根据本发明，过量表达如本文所述铁调节多肽的转基因植物可从土壤摄取微量元 素(铁，锌，锰)并累积这些微量元素在更高的水平，如与对照型植物(野生型、非转基因）相 比。如本文所使用的"对照植物"是指不包含用于表达赋予增强性状的蛋白质的重组DNA的 植物。合适的对照植物可以是用于产生转基因植物的亲代系的非转基因植物，如，缺乏重组 DNA的植物。在一些实施方案中，过表达如本文中所述铁调节多肽的本发明的转基因植物表 现出增加的铁，锌或锰，其是在相同条件生长的对照植物的约1.1倍至15倍。在一些实施方 案中，微量元素可以在地上组织(aerial tissue)，如叶或幼芽中累积，也可以在种子或果 实、或根中积累。如以下实施例所示，（由35Spro: : Atlg47400cDNA转化的）本发明的转基因植 物的矿物质营养分析显示相对于野生型15倍增加的铁，6.8倍的Μη和3.4倍更高的锌浓度， 并且重要的是，在转基因系中种子的铁浓度增加2至3倍。参见图2Β。在一个具体实施例中， 携带表达如本文中所述的铁-调节多肽的重组构建体(35Spro: :AtIMAld)NA)的转基因西红 柿植物与不含重组构建体的野生型西红柿植物相比在果实中在铁水平上获得60%的增加。 参见图4。
[0077] 根据本发明，还发现保守C末端基序对于如本文所述的铁调节多肽的功能是至关 重要的。如在以下实施例中所示，含有铁调节多肽的全长编码序列（例如，拟南芥頂A1，S