一种促进微生物产聚乙烯醇降解酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种促进微生物产聚乙烯醇降解酶的方法，属于纺织技术领域。
【背景技术】
[0002]聚乙烯醇(PVA)是一种人工合成的水溶性高分子聚合物。因其具有pH稳定、混溶性好及乳化能力强等优良特性，同时对天然纤维和一般的合成纤维具有较好的粘附性、成膜性和耐磨性，是目前涤棉织物经纱上浆中的主要浆料。采用PVA上浆的织物，在纺织前处理过程中必须经过退浆处理才能增加其吸水性。传统的退浆方法是使用70?90°C的热水对棉织物进行洗脱，洗脱下的PVA随废水排出。这样不仅水耗、能耗大，而且容易对棉纤维造成损伤;更严重的是由于PVA化学耗氧量大，可生化性较差，给水体造成了严重的污染。
[0003]随着人们对纺织工业清洁生产的关注，在退浆工艺中实现对PVA的生物降解受到研究者么的重视。PVA降解酶退浆条件温和，不仅能大大减少PVA废水的排放，而且能够避免传统退浆过程中高温和氧化造成的棉纤维的损伤。
[0004]实现对PVA生物降解的关键在于能够筛选到能够高效降解PVA的微生物，但PVA降解菌在种类和分布上不多，培养周期长，酶活低，提取不易，这些都成为了阻碍PVA降解酶在实际生产上应用的重要因素。
[0005]目前产聚乙烯醇降解酶多以高聚合度聚乙烯醇、葡萄糖为碳源和诱导物，且多以单菌为主。而且采用高聚合度聚乙烯醇作为诱导剂时，存在高聚合度聚乙烯醇极易絮凝、会影响微生物对聚乙烯醇的降解、进而导致产酶量降低的缺点。
【发明内容】
[0006]为了解决上述问题，本发明提供了一种提高微生物产聚乙烯醇降解酶的方法，是以小分子多元醇作为诱导剂，促使其产生胞内酶。
[0007]在本发明的一种实施方式中，所述小分子多元醇包括以下任意一种或者多种混合:丙二醇、1，3-丁二醇、1，2，4-丁二醇。
[0008]在本发明的一种实施方式中，所述小分子多元醇是4?6g/L的1，3_丁二醇。
[0009]在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂添加量为2?6g/L。
[0010]在本发明的一种实施方式中，所述微生物为混合菌群，主要包括以下几种菌属:Stenotrophomonas sp.^Pseudomonas sp.、Sphingopyxis sp.^Ochrobactrum sp.、Shinella sp.、Castellaniella sp.、Microbacterium sp.0
[0011]在本发明的一种实施方式中，所述混合菌群，来自受PVA污染的纺织厂曝气池中的污泥。
[0012]在本发明的一种实施方式中，所述混合菌群中的Stenotrophomonas sp.可以是以下任意一种:CGMCC No 6393, CGMCC No 9046 ； Pseudomonas sp.可以是以下任意一种:CGMCC Nol0601，CGMCC No 6446 ； Sphingopyxis sp.可以是以下任意一种:CGMCC No10900,CGMCC No 9098 ；Ochrobactrum sp.可以是以下任意一种:CGMCC No 10564,CGMCCNo 10477；Shinella sp.可以是以下任意一种:CGMCC No 6838；Castellanie 11a sp.可以是以下任意一种:CGMCC No 10715,CGMCC No 10720；Microbacterium sp.可以是以下任意一种:CGMCC No6777，CGMCC No 10251。
[0013]在本发明的一种实施方式中，所述混合菌群中还可以含有Bosea sp.、Delftiasp.、Phenylobacterium sp.、Devosia sp.、Rhizobium sp.、Pseudoxanthobacter sp.、Leucobacter sp.等菌种，这些菌种的存在不会对所产粗酶液在PVA降解中产生不利影响。
[0014]在本发明的一种实施方式中，所述方法:以含有小分子多元醇作为诱导剂的肉汤培养基对混合菌群进行培养，促使其产生胞内酶。
[0015]在本发明的一种实施方式中，所述方法，是将混合菌群(按菌质量比，Stenotrophomonas sp:Pseudomonas sp.:Sphingopyxis sp.:Ochrobactrum sp.:Shinella sp.:Castellaniella sp:Microbacterium sp.约为5817:1568:24:39:36:7:31;或者还含有少量其他菌株，M icrobacter i um sp.、Bosea sp:Delftia sp.、Phenylobacterium sp.、Devosia sp:Rhizobium sp、Pseudoxanthobacter sp.、Leucobacter sp.)于肉汤培养基上培养制备种子液，然后接种于含有4?6g/L的小分子多元醇的肉汤培养基中，于30°C发酵3天，然后收集细胞、破壁，离心取上清液为粗酶液。
[0016]在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括对诱导产酶后的细胞进行破壁处理，破壁完成后离心取上清即为所产胞内酶的粗酶液。该粗酶液中含有PVA氧化酶(一种仲醇氧化酶)、PVA水解酶(一种β-双酮水解酶)。
[0017]在本发明的一种实施方式中，所述肉汤培养基，含有蛋白胨10.0?15.0g/L、牛肉粉3.0?5.0g/L、2?6g/L的小分子多元醇、氯化钠5.0?6.0g/L,pH 7.2±0.2。
[0018]本发明的有益效果:
[0019](1)采用添加小分子多元醇作为诱导剂，显著提高了混合菌群所产粗酶液的PVA降解酶酶活，有效降低了在降解聚乙烯醇浆料时所需要的粗酶液用量，节约了制备粗酶液的培养时间、培养成本，适合工业上应用。
[0020](2)对于产聚乙烯醇降解酶的微生物培养，普遍的方法是以聚合度1700左右的聚乙烯醇为碳源和诱导物，但是高聚合度的聚乙烯醇在培养基中降解不完全，酶提取过程中会和酶蛋白一起沉淀产生不能溶解的絮凝物，导致得不到PVA降解酶产品。本发明以肉汤培养基加小分子多元醇作为诱导物对微生物进行培养，既避免了絮凝的出现，又解决了 PVA降解酶分离困难的问题。
[0021 ] (3)粗酶液中含有PVA氧化酶(仲醇氧化酶)、PVA水解酶(β-双酮水解酶)等多种协同降解PVA的酶系，该酶液可用来有效降解高聚合度的聚乙烯醇，获得的粗酶液对PVA1799的降解酶酶活达1.985U/mL。葡萄糖诱导不出酶。
【具体实施方式】
[0022]酶活测定方法:
[0023]以lg/L的PVA1799为底物进行酶活测试。
[0024]酶活测定:在25mL比色管中加入lmL粗酶液和lmL lg/L的PVA溶液，将此混合体系于30°C的振荡水浴锅中反应6h，分别测定反应前后混合液所对应的PVA含量的吸光度。每分钟吸光度下降0.001定义为一个酶活单位。
[0025]超声细胞破碎:
[0026]培养完成的菌体离心(lOOOOr/min)，去除上清，用去离子水洗涤沉淀，充分振荡后离心(10000r/min)，去除上清，重复以上操作多次，将沉淀物悬浮于磷酸盐缓冲溶液(pH7.2，2011111101/1)，质量比约为1:5，用超声破碎(4°(3，400￥，工作38，间隙28，201^11)并离心收集上清液，即为所产的胞内酶粗酶液。
[0027]实施例1:混合菌群产粗酶液(不诱导)
[0028]将混合菌群于肉汤培养基上培养制备种子液，然后再接种于肉汤培养基中，于30°C发酵3天;然后收集细胞、破壁，离心取上清液为粗酶液。
[0029]所述肉汤培养基，含有蛋白胨10.0?15.0g/L、牛肉粉3.0?5.0g/L、氯化钠5.0?6.0g/L,pH 7.2±0.2。
[0030]收集细胞破壁后测定酶活，未检出PVA降解酶活性。
[0031]实施例2:添加1，3-丁二醇诱导剂诱导混合菌群产酶
[0032]将混合菌群于肉汤培养基上培养制备种子液，然后再接种于含有4?6g/L的1，3_丁二醇诱导的肉汤培养基中，于30°C发酵3天;然后收集细胞、破壁，离心取上清液为粗酶液。
[0033]所述肉汤培养基，含有蛋白胨10.0g/L、牛肉粉5.0g/L、氯化钠5.0g/L，1，3_ 丁二醇4-6g/L，pH 7.2±0.2。
[0034]测定粗酶液中酶活，结果显示可达1.985U/mL。
[0035]实施例3:添加丙二醇诱导剂诱导混合菌群产酶
[0036]将混合菌群于肉汤培养基上培养制备种子液，然后再接种于含有2?5g/L的丙二醇的肉汤培养基中，于30°C发酵3天，然后收集细胞、破壁，离心取上清液为粗酶液。
[0037]所述肉汤培养基，含有蛋白胨15.(^/1、牛肉粉3.(^/1、氯化钠6.(^/1，丙二醇2-5g/L，pH 7.2 ± 0.2。测定粗酶液中酶活，结果显示可达1.32U/mL。
[0038]实施例4:添加1，2，4_ 丁三醇诱导剂诱导混合菌群产酶
[0039]将混合菌群于肉汤培养基上培养制备种子液，然后再接种于含有2_4g/L的1，2，4_丁三醇的肉汤培养基中，于30°C发酵3天;然后收集细胞、破壁，离心取上清液为粗酶液。
[0040]所述肉汤培养基，含有蛋白胨12.(^/1、牛肉粉3.0?5.(^/1、氯化钠5.0?6.(^/1，1,2,4-丁三醇2-4g/L，pH 7.2±0.2。测定粗酶液中酶活，结果显示可达1.364U/mL。
[0041 ] 对照例:
[0042](1)将实施例2中的1，3-丁二醇换成3g/L的PVA1799，也可以诱导产酶，但酶活仅1.02U/mL，而且高聚合度的聚乙烯醇在培养基中降解不完全，酶提取过程中会和酶蛋白一起沉淀产生不能溶解的絮凝物，导致得不到PVA降解酶产品。
[0043](2)使用葡萄糖代替实施例2中的1，3_ 丁二醇，得到的发酵液中没有PVA降解酶酶活。
[0044]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1.一种提高微生物产聚乙烯醇降解酶的方法，其特征在于，所述方法是以小分子多元醇作为诱导剂，促使其产生胞内酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子多元醇包括以下任意一种或者多种混合:丙二醇、1，3-丁二醇、1，2，4-丁三醇。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导剂添加量为4?6g/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为混合菌群，主要包括以下几种菌属:Stenotrophomonas sp.；Pseudomonas sp.； Sphingopyxis sp.；Ochrobactrumsp.；Shinella sp.；Castellaniella sp.；Microbacterium sp.。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是以加有小分子多元醇作为诱导剂的肉汤培养基对混合菌群进行培养，促使其产生膜上和胞内酶。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法:是将混合菌群于肉汤培养基上培养制备种子液，然后再接种于含有4?6g/L的小分子多元醇的肉汤培养基中，于30°C发酵3天。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对诱导产酶后的细胞进行破壁处理，破壁完成后离心取上清即为所产的粗酶液。8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述肉汤培养基，含有蛋白胨10.0?15.0g/L、牛肉粉3.0?5.0g/L、氯化钠5.0?6.0g/L、小分子多元醇4_6g/L，pH 7.2±0.2。9.按权利要求1-7任一所述方法得到的聚乙烯醇降解酶。10.权利要求9所述聚乙烯醇降解酶在纺织领域的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种促进微生物产聚乙烯醇降解酶的方法，属于纺织技术领域。本发明通过采用添加小分子多元醇作为诱导剂，显著提高了混合菌群所产粗酶液的PVA降解酶酶活，有效降低了在降解聚乙烯醇浆料时所需要的粗酶液用量，节约了制备粗酶液的培养时间、培养成本，适合工业上应用。本发明方法避免了高聚合度的聚乙烯醇诱导剂导致的絮凝以及PVA降解酶分离困难的问题。
【IPC分类】C12N9/14, D06L1/14, C12N9/04, D06M101/06, D06M16/00
【公开号】CN105462940
【申请号】CN201510961865
【发明人】张颖, 王强, 范雪荣, 张洁, 王平, 袁久刚, 余圆圆, 崔莉
【申请人】江南大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月18日