一种17β-羟基雌甾-4,9-二烯-3-酮的生物制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药和生物化工技术领域，尤其涉及一种17β-羟基雌留-4，9_二 烯-3-酮的生物制备方法。
【背景技术】
[0002] 17β_羟基雌甾-4，9-二烯-3-酮(化合物1，如下，又名甲基双烯醇酮），属于4，9-双 烯物的一种，是留体类抗孕激素药物，如三烯高诺酮，米非司酮等的重要合成中间体。
[0003]
[0004] 现有技术中有部分文献和专利公开了甲基双烯酮及其类似物的合成方法，其中专 利EP0057115、US4386085、Ger 3231827、3231828、3347126及CN 1087090A公开了数种其类 似物化学合成的方法，但合成均为多步反应，过程繁琐，总收率低。
[0005] 专利CN 104530165 Α和US2003/0109728A1公开了一种甲基双烯酮的化学合成方 法，利用5(10)-雄甾烯-19-去甲基-17β-醇-3-酮作为原料(化合物3)合成甲基双烯酮，如下 式所示：
[0006]
[0007]该方法需用到多种有机溶剂如：吡啶、丙酮、二氯甲烷和四氢呋喃等，尤其需要用 到高毒性、刺激性试剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)作为亲核酰化试剂。
[0008] 文献Tetrahedron Letters，1985,26(41) ,5033-5034中公开了一种利用微生物细 胞动力学拆分制备甲基双烯酮的方法，但其底物浓度仅为〇. 2g/L，收率仅为42%。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种17β_羟基雌甾-4,9_二烯-3-酮的生物制备方法，通过此 方法克服了现有技术中采用化学合成法制备甲基双烯酮及其类似物过程中存在的步骤复 杂、总收率低的问题，同时也解决了使用高毒性、刺激性药剂DMAP带来的环境不友好问题； 同时克服了采用了微生物细胞动力学拆分制备甲基双烯酮的过程中，底物浓度低，收率低 的问题。
[0010] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种17β-羟基雌甾-4,9-二烯-3-酮 的生物制备方法，以化合物2为底物，使其在氢供体、辅酶、助溶剂及羰基还原酶的作用下发 生还原反应，生成17β-羟基雌留-4，9-二烯-3-酮，所述的反应在pH为5.5~8.0的缓冲溶液 中进行，反应温度为25~40°C，其中，所述的氢供体为异丙醇，所述的助溶剂为聚乙二醇辛 基苯基醚，所述的辅酶与化合物2的投料质量比为0.01~0.1:1，
[0011] 所述的化合物2的结构式为：
[0012]
0
[0013]优选地，所述的辅酶为NDP。
[0014]优选地，所述的辅酶与化合物2的投料质量比为0.015~0.02:1，所述异丙醇的投 料体积为反应体系总体积的5~7.5%。
[0015]优选地，所述反应在pH为6.0~7.0的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲液中进行。 [0016]优选地，在温度30~35°C条件下进行所述反应。
[0017] 优选地，所述的羰基还原酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司的牌号为EW106的 羰基还原酶1与牌号为EW027的羰基还原酶2两者的组合。
[0018] 进一步优选地，所述的羰基还原酶1、羰基还原酶2与所述化合物2的投料质量比分 别为 0.05 ~0.3:1、0.01 ~0.15:1。
[0019] 更进一步优选地，所述的羰基还原酶1、羰基还原酶2与所述化合物2的投料质量比 分别为 0.14~0.15:1、0.07 ~0.075:1。
[0020] 进一步优选地，所述的羰基还原酶1与羰基还原酶2的投料质量比为0.4~5:1。更 为优选地，羰基还原酶1与羰基还原酶2的投料质量比为2:1。
[0021] 优选地，生物法制备17β_羟基雌甾-4,9_二烯-3-酮的具体实施过程如下:将所述 的化合物2、辅酶、助溶剂、羰基还原酶加入到装有所述缓冲溶液的反应器中，并分批加入所 述氢供体，将所述反应器置于25~40°C的水浴锅中搅拌反应，HPLC检测反应进程，反应结束 后，将反应液真空浓缩至有水分蒸出，反应液过滤，收集滤饼，将滤饼溶解并加热至60~80 °C回流，趁热过滤，收集滤液，滤液浓缩、烘干得产品17β-羟基雌留-4，9-二烯-3-酮。
[0022] 由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
[0023] 1)解决了采用化学合成法制备甲基双烯酮及其类似物过程中，步骤多、过程繁琐、 总收率低的问题；
[0024] 2)解决了以化合物3为底物，通过化学合成法制备甲基双烯酮的过程中，采用多种 有机溶剂及高毒性、刺激性药剂DMAP所带来的环境不友好问题；
[0025] 3)解决了采用微生物细胞动力学拆分制备甲基双烯酮的过程中，底物浓度低，收 率低的问题；
[0026] 4)本发明所采用的酶法还原化合物2得到化合物1，其步骤简单、底物浓度高、酶用 量少、产物收率高，整个过程对环境友好。
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施 例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施 条件为常规实验中的条件。
[0028]实施例1( pH优化）
[0029]向7个4mL反应小管中分别加入140mg化合物2,并分别加入1.7mL 0.1M不同pH的磷 酸盐缓冲液，再在每一个小管中依次加入l〇〇yL异丙醇、100yL聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、2.8mg NAD、20mg羰基还原酶1(购自苏州汉酶生物技术有限公司，牌号EW106,下 同）、l〇mg羰基还原酶2(购自苏州汉酶生物技术有限公司，牌号EW027，下同）置于30°C水浴 锅中搅拌24h，取样检测，底物转化率如表1:
[0030] 表 1
[0031]
[0032]从表1中可看出，在其他条件不变的情况下，在pH为6.5的缓冲溶液中，化合物2的 转化率最高。
[0033]实施例2(温度条件的优化）
[0034] 向5个4mL反应小管中依次加入140mg化合物2、1.7mL 0.1M ρΗ = 6·5磷酸盐缓冲 液、100yL异丙醇、100yL Triton X-100、2.8mg NAD、20mg羰基还原酶l、10mg羰基还原酶2置 于不同温度的水浴锅中搅拌24h，取样检测，底物转化率的结果如表2:
[0035] 表 2
[0036]
[0037] 从表2中可看出，在其他条件不变的情况下，在35°C反应温度条件下，化合物2的转 化率最高。
[0038] 实施例3 (异丙醇投料体积的优化）
[0039] 向6个411^反应小管中依次加入14〇11^化合物2、0.謂？!16.5磷酸盐缓冲液和异丙 醇（共1.9mL)，100yL Triton X_100、lmg NAD、20mg羰基还原酶l、10mg羰基还原酶2置于35 °C水浴锅中搅拌24h，取样检测，底物转化率的结果如表3:
[0040] 表 3
[0041]
[0042] 从表3中可看出，在其他条件不变的'青况下，异丙醇的投料体积占反应体系总体积 的7.5 %时，化合物2的转化率最高。
[0043]实施例4(放大反应）
[0044] 向500mL三口反应瓶中依次加入12g化合物2、380mL 0.1M pH 6.5Tris-HCl缓冲液 和20mL异丙醇、20mL Triton X-100、200mg NAD、1700mg羰基还原酶l、700mg羰基还原酶2置 于35°C水浴锅中搅拌6h再加入20mL异丙醇，反应24h，取样检测，转化率为93.7 %。反应结束 后，于50°C条件下真空浓缩至有明显水分蒸出即可。反应液经三层滤纸过滤，收集滤饼。滤 饼用30倍体积的甲醇溶解并加热至60°C回流30min，趁热过滤，收集滤液。将上述反应液浓 缩至干，得白色固体，置于55°C烘箱过夜得产物1，类白色固体12. lg、纯度95%。
[0045]上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人 士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种17β-羟基雌甾-4,9-二烯-3-酮的生物制备方法，其特征在于，以化合物2为底 物，使其在氢供体、辅酶、助溶剂及羰基还原酶的作用下发生还原反应，生成17β_羟基雌甾-4，9-二烯-3-酮，所述的反应在pH为5.5~8.0的缓冲溶液中进行，反应温度为25~40°C，其 中，所述的氢供体为异丙醇，所述的助溶剂为聚乙二醇辛基苯基醚，所述的辅酶与化合物2 的投料质量比为0.01~0.1:1， 所述的化合物2的结构式为：2. 根据权利要求1所述的17β-羟基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制备方法，其特征在于： 所述的辅酶为NDP。3. 根据权利要求1或2所述的17β-羟基雌留-4,9-二烯-3-酮的生物制备方法，其特征在 于:所述的辅酶与化合物2的投料质量比为0.015~0.02:1，所述异丙醇的投料体积为反应 体系总体积的5~7.5%。4. 根据权利要求1所述的17β-羟基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制备方法，其特征在于： 所述反应在pH为6.0~7.0的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲液中进行。5. 根据权利要求1所述的17β-羟基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制备方法，其特征在于： 在温度30~35°C条件下进行所述反应。6. 根据权利要求1所述的17β-羟基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制备方法，其特征在于： 所述的羰基还原酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司的牌号为EW106的羰基还原酶1与牌 号为EW027的羰基还原酶2两者的组合。7. 根据权利要求6所述的17β-羟基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制备方法，其特征在于： 所述的羰基还原酶1、羰基还原酶2与所述化合物2的投料质量比分别为0.05~0.3:1、0.01 ~0.15:1。8. 根据权利要求7所述的17β-羟基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制备方法，其特征在于： 所述的羰基还原酶1、羰基还原酶2与所述化合物2的投料质量比分别为0.14~0.15:1、0.07 ~0.075:1 〇9. 根据权利要求6至8任一权利要求所述的17β-羟基雌留-4,9-二烯-3-酮的生物制备 方法，其特征在于:所述的羰基还原酶1与羰基还原酶2的投料质量比为0.4~5:1。10. 根据权利要求1所述的7β_羟基雌留-4，9-二烯-3-酮的生物制备方法，其特征在于， 具体实施过程如下:将所述的化合物2、辅酶、助溶剂、羰基还原酶加入到装有所述缓冲溶液 的反应器中，并分批加入所述氢供体，将所述反应器置于25~40°C的水浴锅中搅拌反应， HPLC检测反应进程，反应结束后，将反应液真空浓缩至有水分蒸出，反应液过滤，收集滤饼， 将滤饼溶解并加热至60~80°C回流，趁热过滤，收集滤液，滤液浓缩、烘干得产品17β-羟基 雌甾-4,9-二烯-3-酮。
【专利摘要】<b>本发明公开了一种17β-羟基雌甾-4,9-二烯-3-酮的生物制备方法，该方法以化合物2为底物，使其在氢供体、辅酶、助溶剂及羰基还原酶的作用下发生还原反应，生成17β-羟基雌甾-4,9-二烯-3-酮，所述的反应在pH为5.5~8.0的缓冲溶液中进行，反应温度为25~40℃，其中，所述的氢供体为异丙醇，所述的助溶剂为聚乙二醇辛基苯基醚，所述的辅酶与化合物2的投料质量比为0.01~0.1:1。该方法克服了传统方法的步骤多、过程繁琐、收率低、对环境不友好的问题，且该方法在制备过程中，底物浓度高、产物收率高、与环境友好，解决了现有技术中无酶法制备17β-羟基雌甾-4,9-二烯-3-酮的问题。</b>
【IPC分类】C12P33/16
【公开号】CN105483199
【申请号】CN201511018260
【发明人】陶军华, 乐庸堂, 梁晓亮
【申请人】苏州汉酶生物技术有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月30日