基质金属蛋白酶10抑制多肽及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基质金属蛋白酶10抑制多妝，具体涉及具有抑制基质金属蛋白酶10， 具有减轻骨质疏松症的多肽。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松即骨质疏松症(osteoporosis)，是多种原因引起的一组骨病，骨组织有 正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。 在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折为特 征。
[0003] 目前，用于治疗和阻止骨质疏松症发展的药物分为两大类，第一类为抑制骨吸收 药，包括钙剂、维生素 D及活性维生素 D、降钙素、二磷酸盐、雌激素以及异黄酮;第二类为促 进骨性成药，包括氟化物、合成类固醇、甲状旁腺激素以及异黄酮。这些药物可以阻止骨吸 收但对骨形成的作用特别小。
[0004] 基质金属蛋白酶家族参与多种正常的生理功能，例如卵细胞着床，骨骼生长和器 官发育等。基质金属蛋白酶被更多的看作是这些病理过程的调节因子。基质金属蛋白酶-10 (MMP-10)属于基质金属蛋白酶家族中基质水解酶成员，被称为基质溶素，在骨骼形成的成 骨细胞和生长板的软骨细胞中高度表达。在人体中，诱导成肌细胞转化为成骨细胞，并参与 胞外骨基质的降解代谢。因此，血浆中基质金属蛋白酶10的含量升高与骨密度下降密切相 关。基质金属蛋白酶10可以抑制骨质的形成。因此，抑制基质金属蛋白酶10可以有效促进骨 质的形成。这一发现为骨质疏松患者的治疗找到了新的突破口。尽管如此，并没有成熟开发 的基质金属蛋白酶10抑制剂问世，用于治疗骨质疏松症。
【发明内容】
[0005] 发明目的
[0006] 本发明提供全新的序列，该序列基质金属蛋白酶10抑制多肽，可用于治疗骨质疏 松症。
[0007] 技术方案
[0008] 基质金属蛋白酶10抑制多肽，其特征在于其序列为EEVTPLTFSRLYEGEADBOSFAVKE ，其多肽在治疗骨质疏松症的应用。
[0009] 有益效果
[0010] 基质金属蛋白酶10抑制多肽具有全新的序列，该多肽可体外抑制基质金属蛋白酶 10的酶活力。在体试验研究表明，我们设计的抑制多肽可以缓解骨质疏松模型动物的骨密 度下降。
【具体实施方式】 [0011] 实施例1
[0012] 多肽的化学合成方法
[0013] 多肽用Fmoc化学方法合成。合成反应从C端向N端进行，Rink介质（可在Advanced ChemTech公司购得)上有自由氨基，按C端向N端的顺序将各个氨基酸连接。每一步连接过程 中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU，H0Bt，DIEA和 Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑的混合物来封 闭未连接的自由氨基。每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上 的Fmoc-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20%哌啶的二甲基甲酰胺。最后，当所有氨基酸残基 顺序连接之后，多肽用98%三氟乙酸从介质上切割下来。
[0014] 应用上述化学条件可合成并获得多肽，序列为EEVTPLTFSRLYEGEADIMISFAVKE，该 序列为全新序列。
[0015] 实施例2
[0016]抑制多肽体外对基质金属蛋白酶10的IC50值。
[0017] 重组人基质金属蛋白酶10酶活力的检测是通过切割荧光产生多肽底物1&4找-Pro-Ly S-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Ly s (Dnp)-NH2 并检测产生的焚光值实现的（激发波 长= 328nm,检测波长= 392nm)。所有的检测在37°C下100μΙ反应体系中进行。活化时基质金 属蛋白酶10的浓度为lOOng/μΚ?μΜ)。反应开始时向反应体系中加10μ1基质金属蛋白酶-10 存储液（IngAU)底物的终浓度为ΙΟμΜ。实施例1的基质金属蛋白酶10抑制多肽的IC50值为 11.81umol〇
[0018] 实施例3
[0019] 抑制多肽对体外培养人成骨细胞的生长EC50。
[0020] 采用MTT比色法。将对数生长的人成骨细胞，以1.0 X IO5加入96孔培养板中，培养 24h，实验孔、分别加入不同浓度的实验药物实施例1多肽(上海吉尔合成）；空白组加入相同 体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养48h后，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min， 在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式成骨细胞增殖率=(1 一实验组吸光值/对照组吸 光值）X 100%。计算出实施例1多肽的EC50为4.31μΜ。
[0021 ] 实施例4
[0022]实施例1抑制多肽对大鼠骨密度的影响:取50只大鼠随机分为5组:高剂量组、中剂 量组、低剂量组，阳性对照组，模型组，每组10只。造模及治疗大鼠用10%的水合氯醛以3ml/ 100g行腹腔注射，麻醉满意后，将大鼠仰卧位固定于事先制作的老鼠手术台上，于腹股沟正 中处做纵切口，长约2cm，切开皮肤及皮下筋膜，水平切断左侧股神经，靠近上段予以切除 5_，并作神经断端打结，缝合切口。再将大鼠取俯卧位固定于手术台上，在股骨大转子与靠 近尾部之间与后外方45°方向行长约Icm的切口，暴露坐骨神经，靠近近端予以切除5mm，并 作神经断端打结，缝合切口，普通喂养13周后给药。治疗:模型组按照lml/lOOg的剂量灌胃 生理盐水；阳性对照组灌胃2.Oml二磷酸盐;高中低剂量组分别给予实施例1抑制多肽0.5， 1.0,2mg/Kg灌胃，连续给药10周。先采用双能X线骨密度仪测双侧股骨骨密度。
[0023] 结果:如表1。与模型组大鼠相比，实施例1抑制多肽低、中、高剂量能显著性缓解大 鼠骨密度下降(P〈〇.〇5)。
[0024] 表1实施例1抑制多肽对大鼠骨密度的作用
[0025]
[0027] *p〈〇 · 05，#p〈0 · 01 与模型组相比。
【主权项】
1. 基质金属蛋白酶10抑制剂多肽，其特征在于其序列为EEVTPLTFSRLYEGEAD頂1 SFAVKE。2. 根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶10抑制多肽在治疗骨质疏松症的应用。
【专利摘要】本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制基质金属蛋白酶10具有减轻骨质疏松的多肽。其序列为EEVTPLTFSRLYEGEADIMISFAVKE是全新的序列，它们可以在体外抑制基质金属蛋白酶10的活力，并在体内试验中可以缓解骨质疏松模型动物的骨密度下降，具有潜在的新药开发价值。
【IPC分类】C07K14/00, A61P19/10, A61K38/16
【公开号】CN105504028
【申请号】CN201610065820
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月30日